高糖诱导HUVECs铁死亡模型的建立与验证
验证高糖环境是否诱导HUVECs发生铁死亡
用25.5 mM HG和Erastin处理HUVECs 24小时，通过细胞形态观察、DHE染色、TEM、EdU实验和Western blot检测铁死亡相关蛋白（ACSL4、GPX4）
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
荭草苷通过激活Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡促进糖尿病创面愈合
Orientin promotes diabetic wounds healing by suppressing ferroptosis via activation of the Nrf2/GPX4 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HUVECs高糖模型、铁死亡检测、功能实验、Nrf2 siRNA敲低）和体内小鼠糖尿病创面模型（STZ诱导、组织学与免疫荧光检测）两个独立证据层级，并明确进行了机制验证。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs）高糖（HG）模型 链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠创面模型
重点核对
高糖（HG）浓度：25.5 mM，对照5.5 mM，处理24小时 荭草苷（Ori）处理浓度：20 μM（安全最高浓度） Fer-1处理浓度：10 μM（挽救HG诱导的细胞活力） STZ诱导糖尿病：腹腔注射100 mg/kg，血糖>300 mg/dL的小鼠纳入实验 体内给药：Ori（10 mg/kg/天）和Fer-1（5 mg/kg/天）腹腔注射，创面建立后第5、10、15天取材
摘要
糖尿病患者常因高糖条件下人脐静脉内皮细胞功能受损而出现创面愈合延迟。这是因为高糖条件引发不受控制的脂质过氧化，导致由糖脂毒性引起的铁依赖性铁死亡。然而，天然黄酮类化合物荭草苷具有抗炎生物活性，是多种疾病的有前景的治疗方法。本研究旨在探讨荭草苷在高糖介导的铁死亡中的作用和机制。通过腹腔注射链脲佐菌素建立小鼠糖尿病创面模型，并在高糖条件下培养人脐静脉内皮细胞以创建体外糖尿病环境。结果表明，荭草苷抑制高糖介导的铁死亡，降低丙二醛、脂质过氧化和线粒体活性氧水平，同时增加谷胱甘肽水平。荭草苷治疗还改善了创面谷胱甘肽过氧化物酶4和血管生成标志物的表达，逆转了糖尿病引起的创面愈合延迟。进一步的机制研究表明，荭草苷可能刺激核因子E2相关因子2/GPX4信号通路。在高糖培养的人脐静脉内皮细胞中沉默Nrf2消除了荭草苷介导的有益作用。通过刺激Nrf2/GPX4信号通路，荭草苷可能通过减少铁死亡加速糖尿病创面愈合。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 荭草苷（Ori）是否以及如何通过抑制铁死亡促进糖尿病创面愈合？
- 核心机制
- 荭草苷通过激活Nrf2/GPX4信号通路，减少ROS积累、恢复线粒体功能，从而抑制高糖诱导的HUVECs铁死亡，促进血管生成相关蛋白表达，加速糖尿病创面愈合。
- 主要证据
- 体外HUVECs高糖模型显示Ori降低铁死亡标志物（ACSL4、MDA、脂质过氧化、mtROS）并恢复GPX4和线粒体功能；Nrf2 siRNA敲低实验证实Ori的保护作用依赖于Nrf2；体内STZ诱导糖尿病小鼠创面模型中，Ori和Fer-1加速创面愈合，增加血管生成标志物（VEGF、CD31）和GPX4表达。
- 研究意义
- 该研究表明荭草苷可能成为治疗糖尿病创面的潜在治疗药物，通过激活Nrf2/GPX4通路改善创面愈合。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
荭草苷对HG诱导HUVECs细胞活力的影响
确定Ori的安全浓度及对HG诱导细胞毒性的保护作用
用不同浓度Ori（0-100 μM）处理HUVECs 24/48小时，通过CCK-8测定细胞活力；随后用HG和不同浓度Ori共处理，确定挽救HG诱导细胞活力的最佳浓度
荭草苷抑制HG诱导的HUVECs铁死亡
评估Ori对HG诱导铁死亡标志物的影响
使用FerroOrange检测Fe2+，C11-BODIPY检测脂质过氧化，Western blot检测ACSL4和GPX4，试剂盒检测MDA和GSH
荭草苷缓解HG诱导的线粒体功能障碍
评估Ori对高糖引起的线粒体功能障碍的保护作用
利用DHE检测ROS，MitoSox流式检测mtROS，JC-1检测线粒体膜电位，Western blot检测MFN1/MFN2表达
荭草苷恢复HG处理的HUVECs细胞功能
评估Ori对HG抑制的内皮细胞功能（成管、迁移、粘附）的恢复作用
进行管形成实验、Transwell迁移实验、纤维连接蛋白粘附实验，并用Western blot检测血管生成相关蛋白AAMP和VEGF-A
网络药理学分析和分子对接预测Ori靶点
预测Ori治疗糖尿病创面的潜在靶点和通路
使用TCMSP、SEA、SuperPRED数据库获取Ori靶点，OMIM和GeneCard获取糖尿病创面靶点，构建PPI网络和KEGG富集分析；用AutoDock Vina进行Ori与Nrf2和GPX4的分子对接
验证Ori通过Nrf2/GPX4通路抑制铁死亡
验证Ori是否通过激活Nrf2/GPX4通路起作用
Western blot检测n-Nrf2和GPX4表达，GPX4免疫荧光染色；用Nrf2-siRNA转染HUVECs，观察对Ori功能的影响
体内验证Ori促进糖尿病小鼠创面愈合
评估Ori对糖尿病小鼠创面愈合的促进作用
通过STZ诱导糖尿病小鼠，建立全层皮肤创面，每日腹腔注射Ori或Fer-1，在术后第5、10、15天观察创面闭合率，并进行H&E和Masson染色评价组织学变化
体内验证Ori促进血管生成和GPX4表达
评估Ori对糖尿病创面血管生成和GPX4表达的影响
用免疫组化和免疫荧光染色检测VEGF、CD31、α-SMA和GPX4的表达
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞增殖检测
蛋白表达检测
生物信息学分析
基因敲低
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 荭草苷 | MedChemExpress | HY-N0405 |
| Erastin | MedChemExpress | -- | |
| Ferrostatin-1 | MedChemExpress | -- | |
| Western blot | ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 |
| GPX4抗体 | Abcam | ab252833 | |
| MFN1抗体 | Abcam | ab221661 | |
| MFN2抗体 | Abcam | ab205236 | |
| GAPDH抗体 | Abcam | 9485 | |
| Nrf2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 免疫荧光/免疫组化 | CD31抗体 | Proteintech | 11265-1-AP |
| Western blot | VEGF多克隆抗体 | Proteintech | 19003-1-AP |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 0.25%胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| T-75细胞培养瓶 | Falcon | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Elabscience | -- |
| 细胞增殖检测 | EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | -- |
| 核染色 | DAPI | Beyotime | -- |
| 脂质过氧化检测 | C11-BODIPY | Invitrogen | -- |
| Fe2+检测 | FerroOrange | Dojindo | -- |
| MDA/GSH检测 | MDA检测试剂盒 | Sigma | -- |
| GSH检测试剂盒 | Sigma | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 磷酸酶和蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光试剂 | -- | -- | |
| ChemiDoc XRS+系统 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus荧光显微镜 | Olympus | -- |
| TEM | 日立场发射光学显微镜 | Hitachi | -- |
| ROS检测 | DHE探针 | Yeasen Biotechnology | -- |
| 线粒体功能检测 | MitoSox探针 | -- | -- |
| JC-1探针 | -- | -- | |
| 管形成实验 | ECMatrix胶 | -- | -- |
| 细胞迁移实验 | Costar聚碳酸酯膜Boyden小室 | Costar | -- |
| 细胞粘附实验 | 纤维连接蛋白 | -- | -- |
| 组织学染色 | Masson三色染色 | Beyotime | -- |
| 动物实验 | 链脲佐菌素 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| Western blot | Bio-Rad Image Lab软件 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HUVECs来源（ATCC），培养条件（DMEM, 10% FBS, 1% 青霉素/链霉素，37°C, 5% CO2），细胞密度（2500-3000 cells/cm²） 阅读提示：见Materials and Methods 2.3 Cell culture |
| 高糖诱导 | HG浓度25.5 mM，处理时间24小时，对照5.5 mM 阅读提示：见Results 3.1 |
| 药物处理 | Ori浓度20 μM（安全最高），Fer-1浓度10 μM，处理时间（24小时或48小时） 阅读提示：见Results 3.2 |
| 铁死亡检测 | 检测指标（Fe2+用FerroOrange，脂质过氧化用C11-BODIPY，MDA和GSH用试剂盒，ACSL4/GPX4蛋白表达用Western blot） 阅读提示：见Materials and Methods 2.6, 2.7, 2.8和Results 3.3 |
| 线粒体功能 | ROS检测（DHE）、mtROS（MitoSox）、线粒体膜电位（JC-1）、MFN1/MFN2蛋白表达 阅读提示：见Materials and Methods 2.10, 2.11和Results 3.4 |
| 细胞功能实验 | 管形成实验（ECMatrix凝胶）、迁移实验（Transwell, 8μm孔径, 1×10^4细胞）、粘附实验（Fibronectin预包被） 阅读提示：见Materials and Methods 2.12, 2.13, 2.14 |
| 基因敲低 | Nrf2-siRNA转染（Invitrogen），转染条件（细胞密度30-50%），转染效率验证（Western blot） 阅读提示：见Materials and Methods 2.17 |
| 动物模型 | STZ剂量100 mg/kg腹腔注射，血糖>300 mg/dL，创面直径0.7 cm，面积0.385 cm²，给药剂量（Ori 10 mg/kg/天，Fer-1 5 mg/kg/天） 阅读提示：见Materials and Methods 2.18, 2.19 |
| 取材时间 | 术后第5、10、15天取材，组织学检测（H&E, Masson），免疫组化/免疫荧光（VEGF, CD31, α-SMA, GPX4） 阅读提示：见Materials and Methods 2.20, 2.21和Results 3.7, 3.8 |