验证乳酸在DKD中的产生增加
明确DKD状态下肾脏乳酸水平是否升高及其与肾功能损伤和EMT的关系
检测db/db小鼠肾组织乳酸含量；使用Seahorse分析AGEs诱导的mTEC和HK-2细胞的OCR、ECAR；检测糖酵解和脂肪酸氧化相关基因表达；免疫荧光检测LDHA在肾小管上皮细胞、内皮细胞和足细胞中的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
乳酸通过H3K14la/KLF5通路驱动糖尿病肾病中的上皮-间质转化
Lactate drives epithelial-mesenchymal transition in diabetic kidney disease via the H3K14la/KLF5 pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HK-2、mTEC）、体内动物模型（db/db小鼠）、组学分析（ChIP-seq、RNA-seq）、功能验证（siRNA敲低、AAV肾特异性敲低、药理学抑制）等至少两个独立证据层级，且明确包含功能验证和机制验证。
主要模型
db/db小鼠模型 HK-2人肾小管上皮细胞 小鼠原代肾小管上皮细胞
重点核对
补充乳酸剂量0.5 g/kg体重腹腔注射4周 草氨酸钠剂量0.75 g/kg体重/天腹腔注射4周 ML264剂量10 mg/kg腹腔注射6周 AGEs浓度400 μg/mL处理24小时 H3K14la在KLF5启动子上的富集
摘要
糖尿病肾病患者尿乳酸水平升高是疾病进展的风险增加因素。然而，乳酸如何驱动糖尿病肾病仍未明确。上皮-间质转化以细胞极性丧失和细胞间粘附丧失以及获得间质样表型为特征，被认为是糖尿病肾病的关键贡献者。在这里，我们发现AGEs诱导的肾小管上皮细胞中氧化磷酸化向糖酵解的转换，从而导致肾乳酸水平升高。我们证明降低乳酸水平显著延缓了糖尿病肾病中的上皮-间质转化进展并改善了肾小管纤维化。机制上，我们观察到乳酸增加了糖尿病肾病中组蛋白H3赖氨酸14乳酸化（H3K14la）的水平。ChIP-seq和RNA-seq结果显示组蛋白乳酸化通过促进KLF5表达促进上皮-间质转化过程。此外，KLF5识别cdh1的启动子并抑制其转录，这加速了糖尿病肾病中的上皮-间质转化。另外，肾特异性敲低和药理学抑制KLF5减少了上皮-间质转化的发展并减轻了糖尿病肾病纤维化。因此，我们的研究提供了对糖尿病肾病发病机制的表观遗传调控更好的理解，以及通过破坏乳酸驱动的H3K14la/KLF5通路治疗糖尿病肾病的新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳酸如何促进糖尿病肾病中的上皮-间质转化及其分子机制
- 核心机制
- 乳酸通过促进组蛋白H3K14la修饰，激活KLF5转录，KLF5识别并抑制cdh1启动子活性，导致E-cadherin表达下调，加速上皮-间质转化和肾纤维化。
- 主要证据
- 人肾小管上皮细胞和小鼠原代肾小管上皮细胞中AGEs诱导的糖酵解增强及乳酸产生增加；补充乳酸加重EMT，LDHA抑制剂和KLF5抑制减轻EMT；ChIP-seq/RNA-seq结合ChIP-PCR证实H3K14la富集于KLF5启动子；双荧光素酶报告实验证实KLF5直接抑制cdh1启动子；肾特异性敲低和药理学抑制KLF5在db/db小鼠中改善肾功能和纤维化。
- 研究意义
- 该研究首次揭示乳酸通过H3K14la/KLF5通路促进肾小管上皮细胞EMT，为糖尿病肾病的代谢-表观遗传调控机制提供重要补充，并提示KLF5可能作为糖尿病肾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乳酸对EMT和肾纤维化的影响
外源性补充乳酸或抑制LDHA，观察对DKD小鼠和体外细胞EMT及纤维化的影响
给db/db小鼠腹腔注射乳酸（0.5 g/kg）或LDHA抑制剂草氨酸钠（0.75 g/kg），检测肾功能指标、纤维化相关基因表达、EMT标志物水平及肾组织学变化；细胞实验用乳酸乙酯（10 mM）或草氨酸钠（20 mM）处理AGEs诱导的mTEC，检测EMT标志物。
验证组蛋白乳酸化修饰参与EMT
检测DKD中组蛋白乳酸化水平及其是否受乳酸调控
通过Western blot检测db/db小鼠和AGEs诱导的mTEC中Pan kla和各组蛋白位点乳酸化水平；用Ox处理观察对乳酸化水平的影响；免疫荧光检测Pan kla和H3K14la表达。
鉴定H3K14la下游靶基因
寻找H3K14la调控的、参与EMT的关键靶基因
对AGEs诱导mTEC进行ChIP-seq和RNA-seq，联合分析筛选差异基因；qRT-PCR验证候选基因（klf5、serpine1、dclk2）表达；ChIP-PCR验证H3K14la在靶基因启动子上的富集；siRNA敲低候选基因验证对EMT的影响。
验证KLF5对cdh1转录的抑制
验证KLF5是否直接结合cdh1启动子并抑制其转录
双荧光素酶报告实验检测KLF5过表达对cdh1启动子活性的影响，并用cdh1突变载体和siRNA敲低KLF5进行验证。
体内敲低或抑制KLF5验证其功能
验证降低KLF5表达或活性是否改善DKD小鼠的EMT和肾功能
通过AAV9介导的shRNA在db/db小鼠肾内敲低KLF5，或腹腔注射KLF5抑制剂ML264，检测肾功能指标、EMT标志物、肾组织学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Keygen Biotech | -- |
| 胎牛血清 | Cellmax | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | BioChannel Biological Technology | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | Keygen Biotech | -- | |
| 细胞活性检测 | CCK8试剂盒 | Keygen Biotech | -- |
| 乳酸测定 | 乳酸比色法测定试剂盒 | NanjingJiancheng | -- |
| 肾功能检测 | 血尿素氮试剂盒 | NanjingJiancheng | -- |
| 血清肌酐试剂盒 | NanjingJiancheng | -- | |
| 蛋白检测 | 白蛋白ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解缓冲液 | Wanleibio | -- |
| Western blot | ECL化学发光试剂盒 | Wanleibio | -- |
| 糖酵解酶活性检测 | 己糖激酶活性检测试剂盒 | Solarbio Science Technology | -- |
| 磷酸果糖激酶活性检测试剂盒 | Solarbio Science Technology | -- | |
| 乳酸脱氢酶活性检测试剂盒 | Solarbio Science Technology | -- | |
| RNA提取 | Trizol试剂 | APE × BIO | -- |
| RT-qPCR | cDNA逆转录试剂盒 | TOYOBO | -- |
| SYBR Green SuperMix试剂盒 | TOYOBO | -- | |
| Western blot | SDS-PAGE蛋白上样缓冲液 | Affinibody LifeScience AG | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Jianglai biology | JL-T0336 |
| AGEs检测 | AGEs ELISA试剂盒 | Jianglai biology | JL-10691 |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| ChIP | SimpleChIP酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9002 |
| 药物处理 | 草氨酸钠 | MedChemExpress | -- |
| ML264 | MedChemExpress | -- | |
| 乳酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞处理 | 甲基乙二醛 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 乳酸乙酯 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 重组小鼠表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胶原酶 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 小干扰RNA | GenePharma | -- | |
| pGL3-basic载体 | -- | -- | |
| pRL-SV40海肾荧光素酶表达质粒 | -- | -- | |
| Western blot | 硝酸纤维素膜 | Millipore Corporation | -- |
| 抗体 | E-钙粘蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 14472 |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 9245 | |
| ZO-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3663 | |
| 波形蛋白抗体 | Affinity | AF7013 | |
| 泛乳酸化赖氨酸抗体 | PTM BIO | PTM-1401RM | |
| H3K14la抗体 | PTM BIO | PTM-1414RM | |
| H3K18la抗体 | PTM BIO | PTM-1406RM | |
| H3K9la抗体 | PTM BIO | PTM-1419RM | |
| H3K23la抗体 | PTM BIO | PTM-1413RM | |
| H3K27la抗体 | PTM BIO | PTM-1428 | |
| H3K14ac抗体 | PTM BIO | PTM-113RM | |
| 乙酰化组蛋白H3抗体 | Affinity | AF4365 | |
| 组蛋白H3抗体 | Affinity | AF0863 | |
| KLF5抗体 | Genetex | GTX103289 | |
| LDHA抗体 | Abcam | ab300637 | |
| CD31抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0311-82 | |
| Nephrin抗体 | Proteintech | 66970-1 | |
| 动物实验 | db/m和db/db小鼠 | Gempharmatech | -- |
| AAV9-m-KLF5 shRNA1-EGFP | Han-heng Biotechnology | -- | |
| Seahorse | Seahorse XFe 96细胞外通量分析仪 | Seahorse Bioscience | -- |
| Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Alicelligent | ALS22013 | |
| Seahorse XF糖酵解压力测试试剂盒 | Alicelligent | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | -- | -- | |
| 组织学 | 烯烃 | -- | -- |
| Triton X-100 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| 显微镜 | FV3000共聚焦扫描显微镜 | -- | -- |
| Western blot | Image J软件 | -- | -- |
| ChIP-seq | DNBSEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| VAHTS Universal DNA文库制备试剂盒（Illumina V3） | Vazyme | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立与分组 | db/db小鼠年龄（12周龄），性别，样本量（每组n=36用于基础检测，干预实验n=6），饲养条件，糖尿病肾病模型确认标准 阅读提示：Materials and methods 2.2 Animals experiment |
| 乳酸补充与LDHA抑制 | 乳酸剂量（0.5 g/kg体重，pH 6.8，腹腔注射，4周），草氨酸钠剂量（0.75 g/kg/天，腹腔注射，4周），给药频率，溶剂对照设置 阅读提示：Materials and methods 2.2 Animals experiment; Results 3.3, 3.4 |
| 体外细胞处理 | 细胞系（HK-2、mTEC），AGEs浓度（400 μg/mL），处理时间（24小时），乳酸乙酯浓度（10 mM），草氨酸钠浓度（20 mM） 阅读提示：Materials and methods 2.5, 2.6; Results 3.1 |
| 组蛋白乳酸化检测 | 抗体（Pan kla、H3K14la等），用于Western blot。 阅读提示：Materials and methods 2.13 Western blots; Results 3.5 |
| 靶基因鉴定与验证 | ChIP-seq和RNA-seq方法（数据处理、差异分析），siRNA序列，ChIP-PCR引物序列 阅读提示：Materials and methods 2.10, 2.11, 2.14; Results 3.6 |
| KLF5活性抑制 | ML264剂量（10 mg/kg，腹腔注射，6周），溶剂对照，给药频率 阅读提示：Materials and methods 2.2 Animals experiment; Results 3.9 |