临床试验验证EGCG对NAFLD患者的作用
评估EGCG对NAFLD患者肝脏脂肪含量和血清DPP4水平的影响。
20名NAFLD患者每日口服300mg EGCG(茶多酚软糖)持续24周,在基线、12周和24周检测肝脏脂肪含量(CAP)、肝硬度、血脂、肝功能及血清DPP4水平。
Epigallocatechin gallate alleviates non-alcoholic fatty liver disease through the inhibition of the expression and activity of Dipeptide kinase 4
包含临床试验(20例患者)、动物模型(HFD小鼠)、细胞实验(HepG2)及机制验证(GST-pulldown、质谱、位点突变),多个证据层级且含功能验证。
C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导NAFLD模型 HepG2细胞油酸和棕榈酸处理NAFLD模型 NAFLD患者(临床试验)
EGCG剂量:患者每日300mg,小鼠饲料含3.2g/kg;细胞50μM 干预时间:患者24周,小鼠24周,细胞24h DPP4抑制:使用Sitagliptin(2μg/ml)验证 DPP4结合位点:Glu206和Tyr666突变质粒
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估EGCG对NAFLD患者肝脏脂肪含量和血清DPP4水平的影响。
20名NAFLD患者每日口服300mg EGCG(茶多酚软糖)持续24周,在基线、12周和24周检测肝脏脂肪含量(CAP)、肝硬度、血脂、肝功能及血清DPP4水平。
验证EGCG在体内对高脂饮食诱导的NAFLD的改善作用及对DPP4表达的影响。
雄性C57BL/6J小鼠随机分为LFD组和HFD组,HFD组喂养12周后分为HFD组和HFD+EGCG组,继续喂养12周,EGCG以3.2g/kg饲料添加。检测体重、肝重、血清脂质、肝功能、肝脏组织学(H&E、油红O)、脂质代谢基因表达及DPP4表达。
在HepG2细胞中验证EGCG对DPP4表达和活性的抑制作用及其对脂质代谢的影响。
HepG2细胞用油酸和棕榈酸(OP)处理建立NAFLD模型,分别用EGCG(50μM)或Sitagliptin(2μg/ml)处理24小时。检测细胞内TG含量、油红O染色、脂质代谢基因表达(Cd36, Slc27a2, Fasn, Acaca等)。
确定EGCG与DPP4结合的关键氨基酸位点。
基于分子对接结果,构建Glu206和Tyr666位点突变的DPP4质粒,转染HepG2细胞后检测EGCG对脂质积累的影响,以确定有效位点。
通过GST-pulldown和质谱鉴定DPP4的结合蛋白,探索EGCG作用的分子机制。
在OP处理的HepG2细胞中,利用GST-pulldown和质谱鉴定DPP4结合蛋白,发现MIF。进一步在细胞和小鼠肝脏中检测MIF表达水平。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 临床试验给药 | 茶多酚软糖片 | Kang Ritang Biotechnology | -- |
| 肝脏脂肪含量测定 | iLivTouch® | HISKY | -- |
| 人体测量 | 身高体重秤 | Changzhou Wujin Weighing Apparatus Co., LTD. | RGZ-160 |
| 卷尺 | M&G | AHT99151 | |
| 血液分析 | Sysmex XN血液分析仪 | Sysmex | -- |
| 生化分析 | 罗氏cobas c701生化分析仪 | Roche | -- |
| 胰岛素和C肽检测 | MAGLUMI 4000化学发光分析仪 | Snibe | -- |
| HbA1c检测 | VARIANT II高效液相色谱仪 | Bio-Rad | -- |
| 动物实验给药 | 表没食子儿茶素没食子酸酯 | Kang Ritang Biotechnology | -- |
| 生化分析 | 甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒 | Jiancheng | -- |
| 油红O染色 | 油红O | Sigma | O0625 |
| 组织固定 | 4%组织细胞固定液 | Solarbio | P1110 |
| 苏木精-伊红染色 | 伊红 | Basso | -- |
| 免疫荧光 | 抗DPP4抗体 | Abcam | ab187048 |
| Alexa Fluor 488标记二抗 | Absin | abs20025 | |
| 含DAPI封片剂 | Beyotime | P0131 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | HyClone | SH30243.01 |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 细胞建模 | 油酸 | Sigma | O7501 |
| 棕榈酸 | Kunchuang | SYSJ001 | |
| 药物处理 | 表没食子儿茶素没食子酸酯 | Sigma | E4143 |
| 西格列汀 | Sigma | PHR1857 | |
| 细胞裂解 | 裂解液 | KeyGEN | -- |
| 甘油三酯检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Jiancheng | A110-1-1 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 细胞转染 | 转染试剂 | Thermo | L3000008 |
| GST-pulldown | GST琼脂糖珠 | ProbeGene | -- |
| 质谱分析 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 甲酸 | Fluka | -- | |
| ELISA | 人DPP4 ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK1121 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Multi Sciences | EK206HS | |
| RNA提取 | RNAiso Plus | TaKaRa | 9108 |
| 逆转录 | 逆转录PCR合成试剂盒 | TaKaRa | RR036A |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Epizyme Biotech | PG113 |
| 封闭液 | Epizyme Biotech | PS108P | |
| TBST缓冲液 | Solarbio | T1086 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Elabscience | E-AB-1003 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | P0018AS | |
| 抗MIF抗体 | Abcam | ab175189 | |
| 抗β-actin抗体 | Absin | abs132001 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床试验 | 患者纳入标准(CAP>244 dB/m)、EGCG剂量(300mg/天)、干预时间(24周)、检测时间点(基线、12、24周) 阅读提示:Methods 2.1-2.5, 2.16;Results 3.1 |
| 动物实验 | 小鼠品系(C57BL/6J)、性别(雄性)、年龄(5周龄)、饮食(LFD 10%脂肪 vs HFD 60%脂肪)、EGCG剂量(3.2g/kg饲料)、干预时间(24周) 阅读提示:Methods 2.6;Results 3.2-3.4 |
| 细胞实验 | 细胞系(HepG2)、培养基(DMEM+10%FBS+1%P/S)、建模试剂(油酸和棕榈酸2:1)、EGCG浓度(50μM)、Sitagliptin浓度(2μg/ml)、处理时间(24h) 阅读提示:Methods 2.10-2.12;Results 3.5 |
| DPP4位点突变实验 | DPP4突变位点(Glu206、Tyr666)、质粒构建和转染方法 阅读提示:Methods 2.13;Results 3.5 |
| GST-pulldown和质谱 | GST融合蛋白表达条件、细胞裂解和孵育时间、质谱分析条件 阅读提示:Methods 2.14-2.15;Results 3.6 |