表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制二肽基肽酶4的表达和活性减轻非酒精性脂肪性肝病

Epigallocatechin gallate alleviates non-alcoholic fatty liver disease through the inhibition of the expression and activity of Dipeptide kinase 4

作者信息Mingfeng Yang, Ruike Yan, Ruohe Sha, Xinxin Wang, Shiting Zhou, Baifeng Li, Qianqian Zheng, Yanli Cao
PMID38936303
期刊Clin Nutr
发布时间2024-08
DOI10.1016/j.clnu.2024.06.018

实验完整度

包含临床试验(20例患者)、动物模型(HFD小鼠)、细胞实验(HepG2)及机制验证(GST-pulldown、质谱、位点突变),多个证据层级且含功能验证。

主要模型

C57BL/6J小鼠高脂饮食诱导NAFLD模型 HepG2细胞油酸和棕榈酸处理NAFLD模型 NAFLD患者(临床试验)

重点核对

EGCG剂量:患者每日300mg,小鼠饲料含3.2g/kg;细胞50μM 干预时间:患者24周,小鼠24周,细胞24h DPP4抑制:使用Sitagliptin(2μg/ml)验证 DPP4结合位点:Glu206和Tyr666突变质粒

摘要

背景:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成为全球最常见的慢性肝病原因,发病率持续上升。目前对患者的治疗选择仅限于饮食改变和运动干预,尚无药物被批准用于治疗该病。因此,迫切需要开发新的治疗策略。我们课题组的研究表明,绿茶中的主要生物活性成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)可能通过抑制二肽基肽酶4(DPP4)的表达和活性,帮助减少肝脏脂肪含量并保护免受肝损伤。本研究调查了EGCG可能改善NAFLD的潜在途径,确定了EGCG与DPP4之间的相互作用位点,并提出了新的临床治疗策略。方法:进行了一项临床随机对照试验,以研究EGCG在NAFLD患者中的潜在疗效。研究比较了EGCG给药前后的相关指标。使用雄性C57BL/6J小鼠喂食高脂饮食构建NAFLD动物模型,观察EGCG对模型小鼠肝脏的改善作用,并研究EGCG减轻NAFLD的潜在途径。使用油酸和棕榈酸处理的HepG2细胞系研究了EGCG与DPP4之间的相互作用机制。使用不同位点被破坏的质粒来鉴定有效的相互作用位点。结果:发现EGCG通过抑制DPP4的表达和活性,抑制脂质积累、抑制炎症、修复脂质代谢紊乱,并改善NAFLD的发病机制。结论:研究结果表明,EGCG对改善NAFLD具有积极作用。这些结果突出了在临床上安全有效治疗NAFLD的新机会。研究编号:ChiCTR2300076741;https://www.chictr.org.cn/

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
EGCG能否通过抑制DPP4的表达和活性来减轻NAFLD,并阐明其具体机制和相互作用位点。
核心机制
EGCG通过抑制DPP4的表达和活性,调节脂质代谢相关基因(如Fasn、Cd36、Cpt1a等),并增强MIF表达,从而减轻肝脏脂质积累和炎症。
主要证据
临床试验显示EGCG显著降低NAFLD患者肝脏脂肪含量和血清DPP4水平;动物模型显示EGCG改善HFD诱导的肝损伤和代谢紊乱;细胞实验显示EGCG通过DPP4抑制脂质积累,且Glu206位点突变消除其作用。
研究意义
研究表明EGCG可能成为治疗NAFLD的安全有效的临床策略,为开发新的治疗药物提供基础。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

临床试验验证EGCG对NAFLD患者的作用

评估EGCG对NAFLD患者肝脏脂肪含量和血清DPP4水平的影响。

20名NAFLD患者每日口服300mg EGCG(茶多酚软糖)持续24周,在基线、12周和24周检测肝脏脂肪含量(CAP)、肝硬度、血脂、肝功能及血清DPP4水平。

2

动物模型验证EGCG对HFD诱导NAFLD的改善作用

验证EGCG在体内对高脂饮食诱导的NAFLD的改善作用及对DPP4表达的影响。

雄性C57BL/6J小鼠随机分为LFD组和HFD组,HFD组喂养12周后分为HFD组和HFD+EGCG组,继续喂养12周,EGCG以3.2g/kg饲料添加。检测体重、肝重、血清脂质、肝功能、肝脏组织学(H&E、油红O)、脂质代谢基因表达及DPP4表达。

3

细胞实验验证EGCG通过DPP4抑制脂质积累

在HepG2细胞中验证EGCG对DPP4表达和活性的抑制作用及其对脂质代谢的影响。

HepG2细胞用油酸和棕榈酸(OP)处理建立NAFLD模型,分别用EGCG(50μM)或Sitagliptin(2μg/ml)处理24小时。检测细胞内TG含量、油红O染色、脂质代谢基因表达(Cd36, Slc27a2, Fasn, Acaca等)。

4

机制研究:鉴定EGCG与DPP4的相互作用位点

确定EGCG与DPP4结合的关键氨基酸位点。

基于分子对接结果,构建Glu206和Tyr666位点突变的DPP4质粒,转染HepG2细胞后检测EGCG对脂质积累的影响,以确定有效位点。

5

机制研究:发现MIF作为DPP4结合蛋白

通过GST-pulldown和质谱鉴定DPP4的结合蛋白,探索EGCG作用的分子机制。

在OP处理的HepG2细胞中,利用GST-pulldown和质谱鉴定DPP4结合蛋白,发现MIF。进一步在细胞和小鼠肝脏中检测MIF表达水平。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
茶多酚软糖片Kang Ritang Biotechnology--
iLivTouch®HISKY--
身高体重秤Changzhou Wujin Weighing Apparatus Co., LTD.RGZ-160
卷尺M&GAHT99151
Sysmex XN血液分析仪Sysmex--
罗氏cobas c701生化分析仪Roche--
MAGLUMI 4000化学发光分析仪Snibe--
VARIANT II高效液相色谱仪Bio-Rad--
表没食子儿茶素没食子酸酯Kang Ritang Biotechnology--
甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶检测试剂盒Jiancheng--
油红OSigmaO0625
4%组织细胞固定液SolarbioP1110
伊红Basso--
抗DPP4抗体Abcamab187048
Alexa Fluor 488标记二抗Absinabs20025
含DAPI封片剂BeyotimeP0131
DMEM培养基HyCloneSH30243.01
胎牛血清BI04-001-1ACS
青霉素-链霉素SolarbioP1400
油酸SigmaO7501
棕榈酸KunchuangSYSJ001
表没食子儿茶素没食子酸酯SigmaE4143
西格列汀SigmaPHR1857
裂解液KeyGEN--
甘油三酯检测试剂盒JianchengA110-1-1
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0012
转染试剂ThermoL3000008
GST琼脂糖珠ProbeGene--
胰蛋白酶Promega--
甲酸Fluka--
人DPP4 ELISA试剂盒Multi SciencesEK1121
小鼠IL-6 ELISA试剂盒Multi SciencesEK206HS
RNAiso PlusTaKaRa9108
逆转录PCR合成试剂盒TaKaRaRR036A
SDS-PAGE凝胶Epizyme BiotechPG113
封闭液Epizyme BiotechPS108P
TBST缓冲液SolarbioT1086
HRP标记抗兔二抗ElabscienceE-AB-1003
ECL化学发光试剂盒BeyotimeP0018AS
抗MIF抗体Abcamab175189
抗β-actin抗体Absinabs132001

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
临床试验
患者纳入标准(CAP>244 dB/m)、EGCG剂量(300mg/天)、干预时间(24周)、检测时间点(基线、12、24周)
阅读提示:Methods 2.1-2.5, 2.16;Results 3.1
动物实验
小鼠品系(C57BL/6J)、性别(雄性)、年龄(5周龄)、饮食(LFD 10%脂肪 vs HFD 60%脂肪)、EGCG剂量(3.2g/kg饲料)、干预时间(24周)
阅读提示:Methods 2.6;Results 3.2-3.4
细胞实验
细胞系(HepG2)、培养基(DMEM+10%FBS+1%P/S)、建模试剂(油酸和棕榈酸2:1)、EGCG浓度(50μM)、Sitagliptin浓度(2μg/ml)、处理时间(24h)
阅读提示:Methods 2.10-2.12;Results 3.5
DPP4位点突变实验
DPP4突变位点(Glu206、Tyr666)、质粒构建和转染方法
阅读提示:Methods 2.13;Results 3.5
GST-pulldown和质谱
GST融合蛋白表达条件、细胞裂解和孵育时间、质谱分析条件
阅读提示:Methods 2.14-2.15;Results 3.6