METTL3作为食管癌的新型诊断和治疗生物标志物及其与糖酵解、铜死亡和ceRNA的关系

METTL3 as a novel diagnosis and treatment biomarker and its association with glycolysis, cuproptosis and ceRNA in oesophageal carcinoma.

作者信息Xu-Sheng Liu, Yu Zhang, Zi-Yue Liu, Yan Gao, Ling-Ling Yuan, Dao-Bing Zeng, Fan Tan, Hua-Bing Wan, Zhi-Jun Pei
PMID38429907
发布时间2024-03
DOI10.1111/jcmm.18195

实验完整度

包含多数据集生物信息学分析、IHC染色、体外细胞实验(增殖、迁移、凋亡、糖酵解)及ceRNA网络预测,但缺乏体内动物实验验证。

主要模型

食管癌细胞系KYSE-150 ESCA患者肿瘤组织及癌旁组织 TCGA-ESCA队列 GEO数据集(GSE5364、GSE20347、GSE29001、GSE38129、GSE63941)

重点核对

METTL3在ESCA组织和细胞系中的表达差异 siRNA干扰METTL3后细胞增殖、迁移、凋亡的变化 METTL3干扰对糖酵解相关基因表达及葡萄糖摄取和乳酸产生的影响 METTL3与糖酵解和铜死亡相关基因的相关性分析 ceRNA网络(SNHG1/hsa-miR-101-3p/METTL3和SNHG6/hsa-miR-101-3p/METTL3)的预测

摘要

METTL3已被证明参与调控多种生物过程。然而,METTL3表达与食管癌(ESCA)中糖酵解、铜死亡相关基因及ceRNA网络之间的关系仍不清楚。从数据库获取ESCA表达谱,并通过差异分析和可视化鉴定目标基因。免疫组织化学(IHC)染色评估METTL3表达差异。对METTL3的共表达谱进行GO、KEGG和GSEA功能富集分析。进行细胞实验以评估METTL3干扰对肿瘤细胞的影响。进行相关性和差异分析以评估METTL3与糖酵解和铜死亡的关系。采用qRT-PCR验证METTL3干扰对糖酵解相关基因的影响。利用在线工具基于ceRNA理论筛选并构建ceRNA网络。与对照组相比,ESCA中METTL3表达显著升高。IHC结果与上述结果一致。富集分析显示METTL3参与多条与肿瘤发展相关的通路。METTL3与糖酵解相关基因和铜死亡相关基因观察到显著相关性。实验证实干扰METTL3显著抑制肿瘤细胞的葡萄糖摄取和乳酸产生,并影响糖酵解相关基因的表达。最后,成功预测并构建了两个潜在的ceRNA网络。我们的研究建立了METTL3过表达与ESCA进展之间的关联。此外,我们提出了METTL3与糖酵解、铜死亡和ceRNA之间的潜在联系,为ESCA提供了一种新的靶向治疗策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
METTL3在食管癌中的表达及其与糖酵解、铜死亡和ceRNA网络的关系。
核心机制
METTL3可能通过上调糖酵解相关基因(SLC2A1、GPI、PFKL、PGK1、ENO1和PKM)促进肿瘤细胞糖酵解,并通过ceRNA网络(SNHG1/hsa-miR-101-3p/METTL3和SNHG6/hsa-miR-101-3p/METTL3)调控其表达;此外,METTL3与铜死亡相关基因DLAT存在潜在关联。
主要证据
多数据集分析显示METTL3在ESCA中高表达,IHC验证;体外实验表明干扰METTL3抑制细胞增殖、迁移并促进凋亡,减少葡萄糖摄取和乳酸产生;qRT-PCR验证糖酵解基因表达变化;生物信息学预测构建ceRNA网络。
研究意义
METTL3可能作为ESCA的诊断生物标志物,并为靶向治疗提供新策略;ceRNA网络提供了潜在的分子治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

数据收集与差异表达分析

鉴定ESCA中失调基因并确认METTL3的差异表达。

从TCGA和GEO数据库下载ESCA表达数据,使用Limma包进行差异分析,鉴定METTL3在肿瘤和正常样本中的表达差异。

2

免疫组化验证

验证METTL3蛋白在ESCA组织中的表达。

对26例ESCA患者的肿瘤组织和癌旁组织进行IHC染色,评估METTL3表达。

3

细胞功能实验

评估METTL3干扰对ESCA细胞增殖、迁移和凋亡的影响。

在KYSE-150细胞中转染METTL3 siRNA,进行EdU、CCK-8、克隆形成、划痕愈合和流式细胞术(凋亡和细胞周期)实验。

4

糖酵解相关实验

验证METTL3对肿瘤细胞糖酵解的影响。

检测METTL3干扰后2-NBDG摄取和乳酸产生,并通过qRT-PCR验证糖酵解相关基因表达。

5

ceRNA网络构建

预测并构建METTL3相关的ceRNA网络。

使用TarBase和mirDIP预测靶向METTL3的miRNA,使用ENCORI和miRNet预测靶向miRNA的lncRNA,通过差异表达分析筛选,最终构建ceRNA网络。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
KYSE-150细胞系BeNa Culture CollectionBNCC359343
Lipofectamine 3000转染试剂InvitrogenL3000015
Trizon试剂CWBIOCW0580S
HiScript II Q RT SuperMix用于qPCRVazymeR223-01
CFX Connect™系统Bio-Rad--
EdU检测试剂盒BeyotimeC0078S
CCK-8试剂盒KeyGenKGA317
细胞周期染色试剂盒MULTISCIENCESCCS012
Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒MULTI SCIENCESAP101
乳酸比色分析试剂盒ElabscienceE-BC-K044-M

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
细胞培养与转染
细胞系:KYSE-150;siRNA序列:si-1012和si-1229;转染试剂:Lipofectamine 3000
阅读提示:Methods, Cell culture and treatment (2.4) and Table 1
IHC染色
样本:26例ESCA患者肿瘤和癌旁组织;抗体:METTL3抗体;评分系统:0-3分;统计:Wilcoxon秩和检验
阅读提示:Methods, Immunohistochemical (IHC) assay (2.2)
细胞功能实验
细胞活性检测:EdU、CCK-8、克隆形成;迁移:划痕愈合;凋亡和周期:流式细胞术
阅读提示:Methods, sections 2.6-2.10 and Results 3.4-3.5
糖酵解检测
2-NBDG摄取和乳酸产生测定;qRT-PCR检测糖酵解基因表达
阅读提示:Methods, sections 2.5, 2.10, 2.11 and Results 3.6
ceRNA网络分析
预测数据库:TarBase, mirDIP, ENCORI, miRNet;差异表达筛选;RNAHybrid验证结合位点
阅读提示:Methods, CeRNA network analysis (2.12) and Results 3.8-3.9