数据收集与差异表达分析
鉴定ESCA中失调基因并确认METTL3的差异表达。
从TCGA和GEO数据库下载ESCA表达数据,使用Limma包进行差异分析,鉴定METTL3在肿瘤和正常样本中的表达差异。
METTL3 as a novel diagnosis and treatment biomarker and its association with glycolysis, cuproptosis and ceRNA in oesophageal carcinoma.
包含多数据集生物信息学分析、IHC染色、体外细胞实验(增殖、迁移、凋亡、糖酵解)及ceRNA网络预测,但缺乏体内动物实验验证。
食管癌细胞系KYSE-150 ESCA患者肿瘤组织及癌旁组织 TCGA-ESCA队列 GEO数据集(GSE5364、GSE20347、GSE29001、GSE38129、GSE63941)
METTL3在ESCA组织和细胞系中的表达差异 siRNA干扰METTL3后细胞增殖、迁移、凋亡的变化 METTL3干扰对糖酵解相关基因表达及葡萄糖摄取和乳酸产生的影响 METTL3与糖酵解和铜死亡相关基因的相关性分析 ceRNA网络(SNHG1/hsa-miR-101-3p/METTL3和SNHG6/hsa-miR-101-3p/METTL3)的预测
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定ESCA中失调基因并确认METTL3的差异表达。
从TCGA和GEO数据库下载ESCA表达数据,使用Limma包进行差异分析,鉴定METTL3在肿瘤和正常样本中的表达差异。
验证METTL3蛋白在ESCA组织中的表达。
对26例ESCA患者的肿瘤组织和癌旁组织进行IHC染色,评估METTL3表达。
评估METTL3干扰对ESCA细胞增殖、迁移和凋亡的影响。
在KYSE-150细胞中转染METTL3 siRNA,进行EdU、CCK-8、克隆形成、划痕愈合和流式细胞术(凋亡和细胞周期)实验。
验证METTL3对肿瘤细胞糖酵解的影响。
检测METTL3干扰后2-NBDG摄取和乳酸产生,并通过qRT-PCR验证糖酵解相关基因表达。
预测并构建METTL3相关的ceRNA网络。
使用TarBase和mirDIP预测靶向METTL3的miRNA,使用ENCORI和miRNet预测靶向miRNA的lncRNA,通过差异表达分析筛选,最终构建ceRNA网络。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | KYSE-150细胞系 | BeNa Culture Collection | BNCC359343 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| RNA提取 | Trizon试剂 | CWBIO | CW0580S |
| cDNA合成 | HiScript II Q RT SuperMix用于qPCR | Vazyme | R223-01 |
| qRT-PCR | CFX Connect™系统 | Bio-Rad | -- |
| EdU增殖实验 | EdU检测试剂盒 | Beyotime | C0078S |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂盒 | KeyGen | KGA317 |
| 细胞周期分析 | 细胞周期染色试剂盒 | MULTISCIENCES | CCS012 |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒 | MULTI SCIENCES | AP101 |
| 乳酸测量 | 乳酸比色分析试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系:KYSE-150;siRNA序列:si-1012和si-1229;转染试剂:Lipofectamine 3000 阅读提示:Methods, Cell culture and treatment (2.4) and Table 1 |
| IHC染色 | 样本:26例ESCA患者肿瘤和癌旁组织;抗体:METTL3抗体;评分系统:0-3分;统计:Wilcoxon秩和检验 阅读提示:Methods, Immunohistochemical (IHC) assay (2.2) |
| 细胞功能实验 | 细胞活性检测:EdU、CCK-8、克隆形成;迁移:划痕愈合;凋亡和周期:流式细胞术 阅读提示:Methods, sections 2.6-2.10 and Results 3.4-3.5 |
| 糖酵解检测 | 2-NBDG摄取和乳酸产生测定;qRT-PCR检测糖酵解基因表达 阅读提示:Methods, sections 2.5, 2.10, 2.11 and Results 3.6 |
| ceRNA网络分析 | 预测数据库:TarBase, mirDIP, ENCORI, miRNet;差异表达筛选;RNAHybrid验证结合位点 阅读提示:Methods, CeRNA network analysis (2.12) and Results 3.8-3.9 |