细胞系构建与缺氧处理
建立GSTZ1敲除和过表达细胞模型，模拟肿瘤微环境缺氧状态
使用CRISPR/Cas9构建GSTZ1-KO HepG2细胞，用AdEasy系统构建GSTZ1-OE Huh7细胞，并在1% O2下培养12小时
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
信号代谢物琥珀酰丙酮通过激活HIF-1α促进GSTZ1缺陷肝细胞癌的血管生成
Signaling metabolite succinylacetone activates HIF-1α and promotes angiogenesis in GSTZ1-deficient hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高体外细胞实验、体内小鼠模型（DEN/CCl4诱导及原位移植模型）、临床样本分析及机制验证（DARTS、CETSA、SPR、PHD2活性测定）等多层级证据。
主要模型
HepG2人肝癌细胞系（GSTZ1敲除） Huh7人肝癌细胞系（GSTZ1过表达） Gstz1基因敲除小鼠肝癌模型（DEN/CCl4诱导） 原位肝癌小鼠模型（BALB/c裸鼠）
重点核对
GSTZ1表达水平与VEGFA在细胞和肝癌组织中的负相关 HIF-1α抑制剂2-ME2处理对血管生成和肿瘤生长的抑制 SA与PHD2的直接结合（DARTS、CETSA、SPR） SA对PHD2活性和HIF-1α羟化的抑制作用 抗PD-L1与2-ME2联合治疗在Gstz1敲除小鼠中的肿瘤抑制作用
摘要
肝细胞癌（HCC）中的异常血管生成与肿瘤生长、进展以及局部或远处转移相关。缺氧诱导因子1α（HIF-1α）是一种转录因子，在肿瘤细胞适应营养缺乏微环境过程中调节血管生成中起主要作用。Krebs循环酶（如琥珀酸脱氢酶和延胡索酸水合酶）的遗传缺陷导致致癌代谢物琥珀酸和延胡索酸升高，从而增加HIF-1α稳定性并激活HIF-1α信号通路。然而，其他代谢物是否调节HIF-1α稳定性仍不清楚。在此，我们报道苯丙氨酸/酪氨酸分解代谢酶谷胱甘肽S-转移酶zeta 1（GSTZ1）的缺陷导致琥珀酰丙酮积累，其结构类似于α-酮戊二酸。琥珀酰丙酮与α-酮戊二酸竞争性结合脯氨酰羟化酶结构域2（PHD2）并抑制PHD2活性，阻止HIF-1α的羟基化，从而导致其稳定化并随之表达血管内皮生长因子（VEGF）。我们的发现表明，GSTZ1可能作为一个重要的肿瘤抑制因子，因为它能够抑制HCC中的HIF-1α/VEGFA轴。此外，我们探索了HIF-1α抑制剂联合抗程序性细胞死亡配体1疗法在Gstz1基因敲除小鼠中有效预防HCC血管生成和肿瘤发生的治疗潜力，提示了一种潜在的HCC治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- GSTZ1缺陷是否通过代谢物琥珀酰丙酮调控HIF-1α稳定性，从而促进肝细胞癌血管生成？
- 核心机制
- GSTZ1缺失导致琥珀酰丙酮积累，SA与α-酮戊二酸竞争性结合PHD2，抑制PHD2活性，减少HIF-1α羟化，稳定HIF-1α，进而上调VEGFA表达，促进血管生成。
- 主要证据
- GSTZ1-KO HepG2细胞中SA水平升高，SA处理剂量依赖性增加HIF-1α蛋白水平；DARTS、CETSA、SPR证实SA与PHD2结合；PHD2活性测定显示GSTZ1缺陷抑制其活性，NTBC可恢复；体内Gstz1-/-小鼠肿瘤VEGFA和CD31表达升高，2-ME2处理可逆转。
- 研究意义
- GSTZ1可能作为HCC肿瘤抑制因子，HIF-1α抑制剂联合抗PD-L1治疗可能为HCC提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
鉴定GSTZ1缺陷在缺氧条件下引起的全局转录变化
对GSTZ1-KO和对照细胞进行RNA-Seq，进行基因集富集分析和差异基因表达分析
体外血管生成实验
评估GSTZ1缺陷通过旁分泌作用对血管内皮细胞功能的影响
收集条件培养基处理HUVECs和HAOECs，进行增殖、迁移、成管实验
主动脉环出芽实验
验证条件培养基对血管新生的促进作用
从C57BL/6小鼠分离主动脉环，在Matrigel中培养并用条件培养基处理
体内肝癌模型
评估GSTZ1缺失对肝癌进展和血管生成的影响
使用DEN/CCl4诱导肝癌模型，比较Gstz1-/-和WT小鼠的肿瘤血管生成
信号通路验证
验证GSTZ1通过HIF-1α调控VEGFA表达
检测HIF-1α蛋白和mRNA水平，使用HIF-1α抑制剂2-ME2和siRNA敲低验证功能
SA的积累与功能验证
验证SA是否介导GSTZ1缺失对HIF-1α的稳定作用
LC/MS检测细胞内SA水平，用SA处理细胞检测HIF-1α表达，并使用NTBC阻断SA合成
PHD2与HIF-1α相互作用分析
验证SA直接结合PHD2并抑制其活性
DARTS、CETSA、SPR实验检测SA与PHD2结合，PHD2活性测定，Co-IP、羟基化测定
体内联合治疗实验
探索HIF-1α抑制剂和抗PD-L1联合治疗对Gstz1敲除小鼠肝癌的效果
使用DEN/CCl4模型，给予2-ME2、抗PD-L1或联合治疗，检测肿瘤生长和免疫细胞浸润
临床样本验证
在患者样本中验证GSTZ1与HIF-1α表达的相关性及SA水平
对HCC组织芯片进行IHC染色，分析GSTZ1和HIF-1α表达相关性，并检测SA浓度
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | Hyclone | -- |
| DMEM培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Natocor | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Hyclone | -- | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | -- |
| HiSeq 4000测序平台 | Illumina | -- | |
| IHC染色 | 抗VEGFA抗体 | Abcam | ab1316 |
| 抗HIF-1α抗体 | Abcam | ab51608 | |
| 抗PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 | |
| 抗小鼠PD-1抗体 | R&D Systems, Bio-Techne | AF1021 | |
| 抗CD31抗体 | Cell Signaling Technology | 77699 | |
| 免疫荧光 | 抗CD31抗体 | Abcam | ab222783 |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-10680 | |
| DAPI染色液 | Roche | -- | |
| 封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | -- |
| Oligofectamine转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| qRT-PCR | PrimeScript RT试剂盒（含gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| Western blot | 核浆蛋白提取试剂盒 | Beyotime | -- |
| 抗GSTZ1抗体 | GeneTex | GTX106109 | |
| 抗VEGFA抗体 | Abcam | ab1316 | |
| 抗HIF-1α抗体 | Cell Signaling Technology | 36169 | |
| 抗羟化HIF-1α抗体 | Cell Signaling Technology | 3434 | |
| 抗β-actin抗体 | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| 抗GAPDH抗体 | Beyotime | AG019 | |
| 抗PHD2抗体 | Cell Signaling Technology | 4835 | |
| 抗MMP2抗体 | GeneTex | GTX133806 | |
| 抗MMP9抗体 | Bioworld | S1241 | |
| PVDF膜 | MilliporeSigma | -- | |
| 超敏化学发光底物试剂盒 | Biosharp | -- | |
| ELISA | 人VEGF Quantikine ELISA试剂盒 | Proteintech | -- |
| 细胞增殖与迁移 | IncuCyte ZOOM活细胞成像系统 | Essen BioScience | -- |
| 划痕器 | Essen BioScience | -- | |
| 细胞迁移 | Transwell小室 | -- | -- |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 显微镜 | IX73显微镜 | Olympus | -- |
| PHD2活性测定 | His标签pET28a PHD2载体 | -- | -- |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- | |
| MES缓冲液 | -- | -- | |
| 三磷酸腺苷 | -- | -- | |
| 辅酶A | -- | -- | |
| 氯化镁 | -- | -- | |
| 琥珀酸 | -- | -- | |
| PHD2活性检测试剂盒 | AmyJet Scientific | -- | |
| 动物实验 | 基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
| 2-甲氧基雌二醇 | MCE | -- | |
| 免疫共沉淀 | 抗IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 5946 |
| 蛋白G琼脂糖珠 | MilliporeSigma | -- | |
| 代谢物检测 | Agilent 1290 Infinity II液相色谱系统 | Agilent | -- |
| Agilent 6495c质谱仪 | Agilent | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA亲和层析柱 | GE Healthcare (Cytiva) | -- |
| 体外羟化实验 | HIF-1α-ODD蛋白 | Abcam | ab48734 |
| 二甲基草酰甘氨酸 | -- | -- | |
| DARTS | M-PER裂解液 | Thermo Fisher Scientific | 78501 |
| 链霉蛋白酶 | TopScience | -- | |
| SPR | Biacore X100仪器 | GE Healthcare Life Sciences (Cytiva) | -- |
| His-PHD2蛋白 | Sino Biological | 11084-H08H | |
| 流式细胞术 | 高尔基体阻断剂 | BD Biosciences | -- |
| Brilliant Violet 510抗小鼠/人CD11b抗体 | BioLegend | 101245 | |
| FITC抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123107 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD4抗体 | BioLegend | 100540 | |
| APC抗小鼠CD206抗体 | BioLegend | 141708 | |
| Brilliant Violet 421抗小鼠CD86抗体 | BioLegend | 105032 | |
| PE抗小鼠FoxP3抗体 | Elabscience | E-AB-F1238D | |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 动物实验 | 二乙基亚硝胺 | MilliporeSigma | -- |
| 2-甲氧基雌二醇 | Selleck | S1233 | |
| 抗PD-L1抗体 | -- | -- | |
| 尼替西农 | Selleck | S5325 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与缺氧处理 | 缺氧浓度1% O2，处理时间12小时；细胞系HepG2和Huh7的培养条件 阅读提示：见Methods的Cell culture 部分，以及图例说明 |
| 体外血管生成实验 | HUVECs和HAOECs的种子密度（增殖2000细胞/孔，迁移1×10^4细胞，成管1×10^4），成管时间6小时，处理条件 阅读提示：见Methods的Cell proliferation and Transwell assays、Endothelial cell tube formation assay |
| 体内肝癌模型 | DEN剂量（75 mg/kg，50 mg/kg），CCl4剂量（2 mL/kg，每周两次），治疗药物剂量（2-ME2 50 mg/kg，抗PD-L1 100 μg/kg），治疗周期4周 阅读提示：见Methods的Gstz1–/– mouse study 部分 |
| PHD2活性测定 | 反应体系组成（MES、ATP、CoA、MgCl2、succinate），反应时间0-8分钟，检测波长340 nm 阅读提示：见Methods的PHD2 activity assay 部分 |
| 代谢物检测 | LC-MS/MS方法，细胞内SA浓度（GSTZ1-KO vs parental），组织SA浓度（WT vs KO） 阅读提示：见Methods的Metabolite detection and analysis 部分 |
| 临床试验验证 | HCC组织样本数量（42对或36对），TCGA数据纳入标准（373例），IHC评分方法 阅读提示：见Methods的Patient specimens 和 TCGA data analysis 部分 |