动物饲养与分组
建立室内饲养和人工草地放牧两种喂养系统,比较其对肉鹅的影响。
180只25日龄Wanfu鹅分为IHF组和AGF组,每组90只,6个重复,每重复15只。IHF组饲喂商业日粮,AGF组每日放牧12小时并补饲。实验持续66天。
Pasture intake protects against commercial diet-induced lipopolysaccharide production facilitated by gut microbiota through activating intestinal alkaline phosphatase enzyme in meat geese.
包含动物模型(肉鹅体内实验)、16S rRNA测序、ELISA、Western blot、免疫荧光、qPCR等多层级验证,涵盖菌群、肠道屏障、氧化应激、炎症通路及代谢指标,并有功能验证。
肉鹅(Wanfu鹅) 人工草地放牧系统(AGF) 室内饲养系统(IHF)
肉鹅品种:Wanfu鹅,25日龄,平均体重693.6g (±3.32) 分组:IHF(n=90)与AGF(n=90),每组6个重复,每重复15只 AGF组每日06:00-18:00放牧,19:00补饲一次 取材时间点:45日龄、60日龄、90日龄 检测指标:血清LPS、ROS、ALP水平,肠道组织mRNA表达、蛋白表达、组织学结构
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立室内饲养和人工草地放牧两种喂养系统,比较其对肉鹅的影响。
180只25日龄Wanfu鹅分为IHF组和AGF组,每组90只,6个重复,每重复15只。IHF组饲喂商业日粮,AGF组每日放牧12小时并补饲。实验持续66天。
评估两种喂养系统对肉鹅盲肠微生物组成和多样性的影响,以及预测LPS生物合成相关功能。
对45、60、90日龄的盲肠内容物进行16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序,分析微生物多样性、物种组成,并使用PICRUSt预测LPS生物合成相关功能。
评估AGF系统对肠道ALP表达和活性、血清及盲肠LPS和ROS水平的影响。
通过ELISA检测血清和盲肠ALP、LPS、ROS水平,通过qPCR检测ALPi、CG5150、CG10827等基因表达,并培养E. coli进行验证。
评估AGF系统对肠道屏障功能和形态结构的影响。
通过H&E染色观察盲肠组织形态,测量绒毛高度、隐窝深度等;通过ELISA检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin水平,通过qPCR检测其mRNA表达以及MUC2、MUC5AC等基因。
评估AGF系统对NF-κB通路活化和系统性炎症的影响。
通过qPCR检测NF-κB通路相关基因和促炎细胞因子mRNA表达,通过免疫荧光检测NF-κB核转位。
评估AGF系统对Nrf2通路激活和抗氧化应激的影响。
通过qPCR检测Nrf2和Nrf2调控基因(NQO1, Gclc, Gclm, GSTA4)的表达,通过免疫荧光检测Nrf2核转位,通过ELISA检测抗氧化酶(HO-1, GSR, T-SOD, GSH-PX, T-AOC, CAT)和MDA水平。
分析肠道微生物与宿主标志物之间的关联,以及肠道ALP与Nrf2通路的相关性。
使用Spearman相关分析和Pearson相关分析,分析前44个宿主标志物与肠道菌群的关系,以及宿主标志物之间的相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | 商业日粮 | -- | -- |
| 黑麦草 | -- | -- | |
| 样本采集 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| LPS、ROS和ALP检测 | ELISA试剂盒 | Shanghai Enzyme Link Biotechnology Co., Ltd | -- |
| E. coli培养 | LB培养基 | Miller's recipe | -- |
| 抗氧化参数检测 | HO-1和GSR ELISA试剂盒 | Shanghai Meilian Biology Technology | -- |
| T-SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、CAT检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | A001-1, | |
| 代谢指标检测 | T-CHO、LDL-C、HDL-C、TG、BUN试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering | A111-1-1, |
| 血糖仪 | Sinocare | -- | |
| 组织切片 | Leica RM2235切片机 | Leica | -- |
| 组织成像 | 尼康NIS-Elements显微镜 | Nikon | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗NF-κB抗体 | Affinity | P65-AF5006 |
| 兔抗Nrf2抗体 | Bioss | bs-1074R | |
| HRP标记的羊抗兔IgG | SeraCare | 5220-0336 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 共聚焦荧光显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma Aldrich | -- | |
| SDS上样缓冲液 | SolarBio | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 蛋白marker | Thermo | -- | |
| 兔ALP一抗 | huabio | ET1601-21 | |
| GAPDH一抗 | Bioswamp | MAB45855 | |
| HRP标记的羊抗兔IgG | Elabscience | E-AB-1003 | |
| HRP标记的羊抗兔IgG | Elabscience | E-AB-1001 | |
| Beyo ECL化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| RT-qPCR | MagZol试剂 | Magen Biotechnology | R4801-02 |
| NanoDrop 2000紫外可见分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(含gDNA去除剂) | TOYOBO | -- | |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotechnology | -- | |
| C1000 Touch PCR热循环仪 | BIO-RAD | -- | |
| 16S rRNA测序 | E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| ABI GeneAmp® 9700 PCR热循环仪 | ABI | -- | |
| AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒 | Axygen Biosciences | -- | |
| Quantus™荧光计 | Promega | -- | |
| Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物饲养 | 肉鹅品种(Wanfu鹅)、初始日龄(25日龄)、初始体重(693.6±3.32g)、分组(IHF和AGF)、每组重复数和每重复鹅数(6重复×15只)、放牧时间(06:00-18:00)和补饲时间(19:00) 阅读提示:Methods: Animals, diets, and housing |
| 饲料配方 | 商业日粮组成(grower和finisher配方)、黑麦草营养成分(干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维等) 阅读提示:Table 1, Methods: Animals, diets, and housing |
| 样本采集 | 取材时间点(45、60、90日龄)、每重复取样数量(6只)、体重范围、血清分离条件(4000×g, 15min, 4°C)、盲肠组织保存条件 阅读提示:Methods: Sample collection |
| 肠道微生物分析 | DNA提取方法、16S rRNA V3-V4引物序列、PCR条件、测序平台(Illumina MiSeq)、生物信息学分析流程(Trimmomatic, FLASH, RDP Classifier等) 阅读提示:Methods: DNA extraction and PCR amplification, Illumina MiSeq sequencing, Processing of sequencing data |
| 关键基因表达检测 | RNA提取试剂、逆转录试剂盒、qPCR master mix、内参基因(β-actin)、2^-ΔΔCT方法 阅读提示:Methods: RNA extraction and RT-qPCR, Supplementary Table 1 |
| 蛋白表达检测 | 抗体信息(ALP、GAPDH、NF-κB、Nrf2)及其稀释比例、封闭液、二抗信息、ECL试剂 阅读提示:Methods: Western blotting analysis of ALP, Immunofluorescence |
| 组织学分析 | H&E染色步骤、切片厚度(7μm)、显微镜设备 阅读提示:Methods: Hematoxylin and eosin staining, Slicing and imaging |
| 统计分析 | 统计软件(SPSS 20.0)、检验方法(unpaired two-tailed student T-Test)、显著性水平(P<0.05) 阅读提示:Methods: Statistical analysis |