放牧采食通过激活肠道碱性磷酸酶,保护肉鹅免受商业日粮诱导的、由肠道微生物群促进的脂多糖产生的影响

Pasture intake protects against commercial diet-induced lipopolysaccharide production facilitated by gut microbiota through activating intestinal alkaline phosphatase enzyme in meat geese.

作者信息Qasim Ali, Sen Ma, Umar Farooq, Jiakuan Niu, Fen Li, Defeng Li, Zhichang Wang, Hao Sun, Yalei Cui, Yinghua Shi
PMID36569878
发布时间2022-12-08
DOI10.3389/fimmu.2022.1041070

实验完整度

高

包含动物模型(肉鹅体内实验)、16S rRNA测序、ELISA、Western blot、免疫荧光、qPCR等多层级验证,涵盖菌群、肠道屏障、氧化应激、炎症通路及代谢指标,并有功能验证。

主要模型

肉鹅(Wanfu鹅) 人工草地放牧系统(AGF) 室内饲养系统(IHF)

重点核对

肉鹅品种:Wanfu鹅,25日龄,平均体重693.6g (±3.32) 分组:IHF(n=90)与AGF(n=90),每组6个重复,每重复15只 AGF组每日06:00-18:00放牧,19:00补饲一次 取材时间点:45日龄、60日龄、90日龄 检测指标:血清LPS、ROS、ALP水平,肠道组织mRNA表达、蛋白表达、组织学结构

摘要

Introduction: Diet strongly affects gut microbiota composition, and gut bacteria can influence the intestinal barrier functions and systemic inflammation through metabolic endotoxemia. In-house feeding system (IHF, a low dietary fiber source) may cause altered cecal microbiota composition and inflammatory responses in meat geese via increased endotoxemia (lipopolysaccharides) with reduced intestinal alkaline phosphatase (ALP) production. The effects of artificial pasture grazing system (AGF, a high dietary fiber source) on modulating gut microbiota architecture and gut barrier functions have not been investigated in meat geese. Therefore, this study aimed to investigate whether intestinal ALP could play a critical role in attenuating reactive oxygen species (ROS) generation and ROS facilitating NF-κB pathway-induced systemic inflammation in meat geese.Methods: The impacts of IHF and AGF systems on gut microbial composition via 16 sRNA sequencing were assessed in meat geese. The host markers analysis through protein expression of serum and cecal tissues, hematoxylin and eosin (H&E) staining, localization of NF-қB and Nrf2 by immunofluorescence analysis, western blotting analysis of ALP, and quantitative PCR of cecal tissues was evaluated.Results and Discussion: In the gut microbiota analysis, meat geese supplemented with pasture showed a significant increase in commensal microbial richness and diversity compared to IHF meat geese demonstrating the antimicrobial, antioxidant, and anti-inflammatory ability of the AGF system. A significant increase in intestinal ALP-induced Nrf2 signaling pathway was confirmed representing LPS dephosphorylation mediated TLR4/MyD88 induced ROS reduction mechanisms in AGF meat geese. Further, the correlation analysis of top 44 host markers with gut microbiota showed that artificial pasture intake protected gut barrier functions via reducing ROS-mediated NF-κB pathway-induced gut permeability, systemic inflammation, and aging phenotypes. In conclusion, the intestinal ALP functions to regulate gut microbial homeostasis and barrier function appear to inhibit pro-inflammatory cytokines by reducing LPS-induced ROS production in AGF meat geese. The AGF system may represent a novel therapy to counteract the chronic inflammatory state leading to low dietary fiber-related diseases in animals.

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
人工草地放牧(高膳食纤维)是否通过调节肠道微生物群和激活肠道碱性磷酸酶(ALP)来减轻商业日粮诱导的脂多糖(LPS)相关的氧化应激和全身炎症?
核心机制
人工草地放牧增加产ALP菌群,肠道ALP通过去磷酸化LPS,阻断TLR4/MyD88通路介导的ROS产生,进而激活Keap1-Nrf2通路,抑制NF-κB介导的促炎细胞因子表达,维护肠道屏障功能,减轻全身炎症和衰老表型。
主要证据
16S rRNA测序显示AGF组微生物丰富度和多样性显著增加;ALP活性、Nrf2通路相关基因和抗氧化酶水平显著升高;LPS、ROS、NF-κB通路和促炎细胞因子mRNA水平显著降低;免疫荧光显示Nrf2核转位增加,NF-κB核转位减少。
研究意义
AGF系统可能代表一种新型疗法,用于对抗动物低膳食纤维相关疾病的慢性炎症状态,若在人类中得到证实,可能有助于理解肠道屏障功能受损相关疾病(如肥胖、溃疡性结肠炎、心血管疾病和克罗恩病)。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物饲养与分组

建立室内饲养和人工草地放牧两种喂养系统,比较其对肉鹅的影响。

180只25日龄Wanfu鹅分为IHF组和AGF组,每组90只,6个重复,每重复15只。IHF组饲喂商业日粮,AGF组每日放牧12小时并补饲。实验持续66天。

2

肠道微生物组成分析

评估两种喂养系统对肉鹅盲肠微生物组成和多样性的影响,以及预测LPS生物合成相关功能。

对45、60、90日龄的盲肠内容物进行16S rRNA基因V3-V4区扩增子测序,分析微生物多样性、物种组成,并使用PICRUSt预测LPS生物合成相关功能。

3

肠道ALP活性和LPS、ROS水平检测

评估AGF系统对肠道ALP表达和活性、血清及盲肠LPS和ROS水平的影响。

通过ELISA检测血清和盲肠ALP、LPS、ROS水平,通过qPCR检测ALPi、CG5150、CG10827等基因表达,并培养E. coli进行验证。

4

肠道屏障功能和形态学评估

评估AGF系统对肠道屏障功能和形态结构的影响。

通过H&E染色观察盲肠组织形态,测量绒毛高度、隐窝深度等;通过ELISA检测紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin水平,通过qPCR检测其mRNA表达以及MUC2、MUC5AC等基因。

5

NF-κB通路和炎症因子检测

评估AGF系统对NF-κB通路活化和系统性炎症的影响。

通过qPCR检测NF-κB通路相关基因和促炎细胞因子mRNA表达,通过免疫荧光检测NF-κB核转位。

6

Nrf2通路和抗氧化应激检测

评估AGF系统对Nrf2通路激活和抗氧化应激的影响。

通过qPCR检测Nrf2和Nrf2调控基因(NQO1, Gclc, Gclm, GSTA4)的表达,通过免疫荧光检测Nrf2核转位,通过ELISA检测抗氧化酶(HO-1, GSR, T-SOD, GSH-PX, T-AOC, CAT)和MDA水平。

7

相关性分析

分析肠道微生物与宿主标志物之间的关联,以及肠道ALP与Nrf2通路的相关性。

使用Spearman相关分析和Pearson相关分析,分析前44个宿主标志物与肠道菌群的关系,以及宿主标志物之间的相关性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
商业日粮----
黑麦草----
磷酸盐缓冲液----
ELISA试剂盒Shanghai Enzyme Link Biotechnology Co., Ltd--
LB培养基Miller's recipe--
HO-1和GSR ELISA试剂盒Shanghai Meilian Biology Technology--
T-SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、CAT检测试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1,
T-CHO、LDL-C、HDL-C、TG、BUN试剂盒Nanjing Jiancheng BioengineeringA111-1-1,
血糖仪Sinocare--
Leica RM2235切片机Leica--
尼康NIS-Elements显微镜Nikon--
兔抗NF-κB抗体AffinityP65-AF5006
兔抗Nrf2抗体Biossbs-1074R
HRP标记的羊抗兔IgGSeraCare5220-0336
DAPI----
共聚焦荧光显微镜Leica--
RIPA裂解液----
蛋白酶抑制剂混合物Sigma Aldrich--
SDS上样缓冲液SolarBio--
PVDF膜Millipore--
蛋白markerThermo--
兔ALP一抗huabioET1601-21
GAPDH一抗BioswampMAB45855
HRP标记的羊抗兔IgGElabscienceE-AB-1003
HRP标记的羊抗兔IgGElabscienceE-AB-1001
Beyo ECL化学发光试剂Beyotime--
MagZol试剂Magen BiotechnologyR4801-02
NanoDrop 2000紫外可见分光光度计Thermo Scientific--
ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix(含gDNA去除剂)TOYOBO--
ChamQ通用SYBR qPCR预混液Vazyme Biotechnology--
C1000 Touch PCR热循环仪BIO-RAD--
E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒Omega Bio-Tek--
ABI GeneAmp® 9700 PCR热循环仪ABI--
AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒Axygen Biosciences--
Quantus™荧光计Promega--
Illumina MiSeq测序平台Illumina--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物饲养
肉鹅品种(Wanfu鹅)、初始日龄(25日龄)、初始体重(693.6±3.32g)、分组(IHF和AGF)、每组重复数和每重复鹅数(6重复×15只)、放牧时间(06:00-18:00)和补饲时间(19:00)
阅读提示:Methods: Animals, diets, and housing
饲料配方
商业日粮组成(grower和finisher配方)、黑麦草营养成分(干物质、粗蛋白、中性洗涤纤维等)
阅读提示:Table 1, Methods: Animals, diets, and housing
样本采集
取材时间点(45、60、90日龄)、每重复取样数量(6只)、体重范围、血清分离条件(4000×g, 15min, 4°C)、盲肠组织保存条件
阅读提示:Methods: Sample collection
肠道微生物分析
DNA提取方法、16S rRNA V3-V4引物序列、PCR条件、测序平台(Illumina MiSeq)、生物信息学分析流程(Trimmomatic, FLASH, RDP Classifier等)
阅读提示:Methods: DNA extraction and PCR amplification, Illumina MiSeq sequencing, Processing of sequencing data
关键基因表达检测
RNA提取试剂、逆转录试剂盒、qPCR master mix、内参基因(β-actin)、2^-ΔΔCT方法
阅读提示:Methods: RNA extraction and RT-qPCR, Supplementary Table 1
蛋白表达检测
抗体信息(ALP、GAPDH、NF-κB、Nrf2)及其稀释比例、封闭液、二抗信息、ECL试剂
阅读提示:Methods: Western blotting analysis of ALP, Immunofluorescence
组织学分析
H&E染色步骤、切片厚度(7μm)、显微镜设备
阅读提示:Methods: Hematoxylin and eosin staining, Slicing and imaging
统计分析
统计软件(SPSS 20.0)、检验方法(unpaired two-tailed student T-Test)、显著性水平(P<0.05)
阅读提示:Methods: Statistical analysis