生信预测和筛选靶向LILRB3的miRNA
预测并验证可能靶向LILRB3 mRNA 3'UTR的miRNA。
使用TargetScan、miRDB、miRWalk数据库预测，并通过qRT-PCR验证候选miRNA表达，再通过双荧光素酶报告实验确认直接靶向关系。
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CLPs-miR-103a-2-5p通过靶向LILRB3和Nrf2/HO-1轴抑制AML细胞增殖并促进细胞凋亡，调节CD8+ T细胞反应
CLPs-miR-103a-2-5p inhibits proliferation and promotes cell apoptosis in AML cells by targeting LILRB3 and Nrf2/HO-1 axis, regulating CD8 + T cell response.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（CCK-8、集落形成、Transwell、流式凋亡/周期）、分子机制验证（双荧光素酶报告、Western blot、RNA-seq）及体内动物模型（皮下和尾静脉异种移植瘤）等多层级验证。
主要模型
AML细胞系（THP-1、OCI-AML2、OCI-AML3、MV4-11） BALB/c-nu小鼠皮下异种移植瘤模型 B-NDG小鼠尾静脉异种移植瘤模型 AML患者骨髓单个核细胞（BMMCs）
重点核对
miR-103a-2-5p mimics转染浓度和转染时间（48小时） AML细胞系与PBMCs共培养比例及时间（24小时或72小时） CLPs-miR-103a-2-5p注射剂量（皮下注射5 μg/只，尾静脉注射10 μg/20 g体重）及频率 异种移植瘤模型使用的小鼠品系、性别和周龄（雌性BALB/c-nu, 6周龄；雌性B-NDG, 6周龄） 统计学方法（独立样本t检验、单因素方差分析、Kaplan-Meier生存分析）
摘要
背景：LILRB3是白细胞免疫球蛋白样受体B（LILRB）家族的成员，具有免疫抑制功能并直接调节癌症发展，这表明LILRB3是癌症诊断和治疗的有吸引力的靶点。急性髓系白血病（AML）的新治疗方法是紧迫和重要的，包括microRNAs（miRNAs）在内的RNA疗法可能是一种有效的选择。在这里，我们研究了在AML微环境中靶向LILRB3的失调miRNA的作用。方法：通过生物信息学网站预测可能与LILRB3 mRNA的3'-非翻译区（3'-UTR）结合的潜在miRNA。然后，我们通过定量实时PCR和双荧光素酶报告基因实验筛选靶向LILRB3的miRNA。确定了AML中LILRB3和microRNA（miR）-103a-2-5p的表达，然后分析了它们之间的相互作用。在体外，通过CCK8、集落形成实验和transwell实验确定了miR-103a-2-5p的作用，而细胞凋亡和细胞周期通过流式细胞术分析。阳离子脂质体（CLPs）用于在AML小鼠模型中递送miR-103a-2-5p，以验证miR-103a-2-5p在体内的潜在作用。结果：LILRB3在AML细胞中上调，而miR-103a-2-5p显著下调。因此，发现它们之间存在负相关。MiR-103a-2-5p直接靶向AML细胞中的LILRB3。过表达的miR-103a-2-5p显著抑制LILRB3的mRNA和蛋白水平，从而抑制AML细胞生长并减少CD8+ T细胞凋亡。此外，过表达的miR-103a-2-5p降低了Nrf2/HO-1通路相关蛋白的相对表达和GSH/ROS的比率，导致过量的细胞内ROS可能促进AML细胞凋亡。在小鼠模型中，通过CLPs递送miR-103a-2-5p可以抑制肿瘤生长。结论：MiR-103a-2-5p作为肿瘤抑制因子，通过下调LILRB3表达、抑制Nrf2/HO-1轴和降低GSH/ROS比率来抑制AML细胞增殖并促进其凋亡。此外，我们的研究结果表明，miR-103a-2-5p可能通过抑制LILRB3表达来增强CD8+ T细胞反应。因此，通过CLPs递送miR-103a-2-5p可能有助于AML的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究miR-103a-2-5p在AML微环境中的失调及其通过靶向LILRB3影响AML细胞增殖、凋亡和CD8+ T细胞反应的作用机制。
- 核心机制
- MiR-103a-2-5p直接靶向LILRB3的3'UTR，下调其表达，进而抑制Nrf2/HO-1通路，降低GSH/ROS比率，导致ROS积累，促进AML细胞凋亡；同时通过抑制LILRB3可能增强CD8+ T细胞反应。
- 主要证据
- 临床样本显示LILRB3上调而miR-103a-2-5p下调，且负相关；双荧光素酶报告实验证实miR-103a-2-5p直接靶向LILRB3；体外过表达miR-103a-2-5p抑制细胞增殖、诱导凋亡，促进CD8+ T细胞存活；体内CLPs递送miR-103a-2-5p抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- miR-103a-2-5p可作为AML的潜在治疗靶点，通过CLPs递送miR-103a-2-5p可能是一种新的免疫治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测LILRB3和miR-103a-2-5p在AML中的表达及相关性
评估LILRB3和miR-103a-2-5p在AML患者和细胞系中的表达水平及它们的相关性。
通过Western blot和qRT-PCR检测LILRB3蛋白和mRNA水平，qRT-PCR检测miR-103a-2-5p水平，并分析相关性。
体外功能验证miR-103a-2-5p对AML细胞的影响
验证过表达miR-103a-2-5p对AML细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移和集落形成的影响。
通过CCK-8、集落形成、Transwell、流式细胞术和Western blot检测相关指标。
验证miR-103a-2-5p对CD8+ T细胞的作用
检测miR-103a-2-5p对CD8+ T细胞凋亡和免疫检查点表达的影响。
将转染miR-103a-2-5p mimics或NC的AML细胞与PBMCs共培养，流式检测CD8+ T细胞凋亡和免疫检查点表达。
机制研究：miR-103a-2-5p调控Nrf2/HO-1通路及ROS
探索miR-103a-2-5p调控AML细胞凋亡的分子机制。
通过RNA-seq、qRT-PCR、Western blot检测Nrf2/HO-1通路相关蛋白，检测GSH水平和ROS生成。
制备和表征阳离子脂质体（CLPs）递送系统
制备并表征CLPs-miR-103a-2-5p纳米颗粒，验证其递送miRNA的能力和稳定性。
采用薄膜水化法制备CLPs，与miR-103a-2-5p自组装，检测粒径、zeta电位、TEM形态及细胞摄取。
体内抗肿瘤效果评估
验证CLPs-miR-103a-2-5p在体内对AML肿瘤生长的抑制作用及安全性。
建立皮下和尾静脉异种移植瘤模型，给予CLPs-miR-103a-2-5p治疗，监测肿瘤体积、体重、生存期，并通过Western blot和IHC分析相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- | |
| 质粒构建与荧光素酶报告实验 | pmirGLO双荧光素酶载体 | IGEbio | -- |
| 荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| RNA提取与qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript逆转录试剂盒 | Vazyme | -- | |
| qRT-PCR | SYBR Green染料检测系统 | Applied Biosystems | -- |
| miRNA qRT-PCR | miRNA第一链cDNA合成试剂盒 | Vazyme | -- |
| miRNA U通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | Dojindo | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 流式细胞术 | Cytoflex流式细胞仪 | Beckman | -- |
| 细胞周期检测 | PI/RNase染色缓冲液 | BD Biosciences | -- |
| 集落形成实验 | 甲基纤维素 | Sigma-Aldrich | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning Inc. | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGEN BioTECH | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 增强化学发光试剂盒 | Fdbio Science | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Tubulin抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| 抗LILRB3抗体 | Proteintech | 18260-1-AP | |
| 抗BAX抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| 抗BCL2抗体 | Proteintech | 12789-1-AP | |
| 抗Caspase 3/p17/p19抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| 抗P21抗体 | Proteintech | 10355-1-AP | |
| 抗Cyclin D1抗体 | Proteintech | 60186-1-Ig | |
| 抗CDK4抗体 | Proteintech | 11026-1-AP | |
| 抗NRF2抗体 | HUABIO | R1312-8 | |
| 抗HO-1抗体 | HUABIO | ET1604-45 | |
| 抗SOD2抗体 | HUABIO | ET1701-54 | |
| 抗NQO1抗体 | HUABIO | JF440-1 | |
| 流式细胞术 | PE抗人LILRB3抗体 | Biolend | 337703 |
| APC抗人CD3抗体 | Biolend | 317317 | |
| FITC抗人CD8a抗体 | Biolend | 344703 | |
| PE抗人CD366 (Tim3)抗体 | Biolend | 364805 | |
| PE抗人CD152 (CTLA4)抗体 | Biolend | 369603 | |
| PE抗人CD223 (LAG3)抗体 | Biolend | 369305 | |
| APC抗人CD279 (PD-1)抗体 | Biolend | 379207 | |
| ROS检测 | DCFH-DA | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| GSH检测 | 还原型谷胱甘肽比色检测试剂盒 | Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| CLPs制备 | DOTAP | Macklin | -- |
| DSPC | Macklin | -- | |
| 胆固醇 | Macklin | -- | |
| DSPE-PEG2000 | WEIHUA BIO | -- | |
| DSPE-PEG-MAL5000 | WEIHUA BIO | -- | |
| CLPs表征 | 纳米粒度及Zeta电位分析仪 | Anton Paar | Litesizer |
| 透射电子显微镜 | JEOL | JEM-2100 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | AX | |
| 动物实验 | BALB/c-nu小鼠 | BIOSYTOGEN | -- |
| B-NDG小鼠 | BIOSYTOGEN | -- | |
| 免疫组化 | DAB显色试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9017 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | 细胞系来源及培养条件（37℃, 5% CO2，RPMI-1640或DMEM，10% FBS），转染试剂和剂量（Lipofectamine 3000），转染时间（48小时） 阅读提示：见方法部分 'Cell lines and culture conditions' 和 'Transfection' |
| 双荧光素酶报告实验 | 报告基因载体构建（LILRB3-WT/MUT），共转染293T细胞，检测时间（转染后48小时），内参（Renilla） 阅读提示：见方法部分 'Plasmid construction and luciferase reporter assay'，图2E-H |
| 体外功能实验 | AML细胞系选择（THP-1, OCI-AML3, OCI-AML2, MV4-11），miR-103a-2-5p mimics或miR-NC浓度和转染时间（48小时），CCK-8检测时间点（0,24,48,72小时），凋亡和周期检测时间（48小时） 阅读提示：见方法部分 'Cell counting kit-8 (CCK-8) assay'、'Apoptosis assay'、'Cell cycle assay'，图4 |
| 共培养实验 | AML细胞与活化PBMCs共培养比例和时长（24或72小时），T细胞凋亡检测染色（Annexin V-APC/PI-PE），免疫检查点染色（CD3, CD8a, PD-1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3） 阅读提示：见方法部分 'Flow cytometry analysis'，图5 |
| 动物实验 | 动物品系、性别、周龄（雌性BALB/c-nu 6周龄；雌性B-NDG 6周龄），细胞注射量（皮下6x10^6 THP-1；尾静脉1x10^6 GFP-THP-1），给药剂量和频率（皮下5 μg/只每3天；尾静脉10 μg/20 g每2天），治疗周期（皮下1个月；尾静脉2周） 阅读提示：见方法部分 'Xenograft assay'，图8 |