临床样本和动物模型中观察巨噬细胞焦亡
检测人胆汁反流性胃炎和小鼠DGR模型中是否存在巨噬细胞焦亡及关键蛋白表达。
收集人胃黏膜活检组织和正常组织，通过IF、western blotting和qRT-PCR检测焦亡相关蛋白；对C57BL/6小鼠进行胃空肠吻合术建立DGR模型，检测胃内容物胆汁酸水平、组织炎症和焦亡蛋白表达。
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USP50调控十二指肠反流诱导的胃肿瘤发生中的NLRP3炎性小体激活
USP50 regulates NLRP3 inflammasome activation in duodenogastric reflux-induced gastric tumorigenesis.
实验完整度
高包含临床标本、小鼠DGR模型、细胞实验等多层级验证，并进行功能获得/丧失及机制研究。
主要模型
人胆汁反流性胃炎和胃癌组织样本 小鼠DGR模型（胃空肠吻合术） PMA分化的U937和RAW264.7巨噬细胞 胃癌细胞系SNU216和HGC27
重点核对
DGR模型通过胃空肠吻合术建立，小鼠品系为6-8周龄C57BL/6雄性，术后6个月分析 体外DGR模型使用TDCA处理PMA分化的U937和RAW264.7细胞，常用浓度200μM，处理24小时 USP50过表达或敲低通过慢病毒载体转导实现 HMGB1中和抗体和重组人HMGB1蛋白用于功能验证 信号通路抑制剂SCH772984（ERK1/2）和MK-2206（AKT）用于机制验证
摘要
十二指肠反流（DGR）与胃癌（GC）的发生有关，尽管确切机制尚不清楚。在此，我们旨在研究反流的胆汁酸（BAs）和巨噬细胞如何参与胃癌发生。在活动性人胆汁反流性胃炎和小鼠DGR模型中，泛素特异性蛋白酶50（USP50）显著升高，且巨噬细胞是上调USP50表达的主要白细胞亚群。增强USP50表达可放大胆汁酸诱导的NLR家族吡啉结构域蛋白3（NLRP3）炎性小体激活及随后高迁移率族蛋白盒1（HMGB1）的释放，而USP50缺陷则导致相反的改变。机制上，USP50与凋亡相关斑点样蛋白含CARD（ASC）相互作用并去泛素化ASC以激活NLRP3炎性小体。HMGB1的释放通过PI3K/AKT和MAPK/ERK通路促进胃肿瘤发生。这些结果可能为胆汁反流相关的胃癌发生提供新的见解，并为预防DGR相关的胃癌提供选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 十二指肠反流中的胆汁酸如何通过巨噬细胞NLRP3炎性小体促进胃肿瘤发生？
- 核心机制
- USP50与ASC相互作用并去除其K63连接的泛素化，促进ASC斑点形成和寡聚化，增强NLRP3炎性小体激活，导致巨噬细胞焦亡和HMGB1释放，进而通过PI3K/AKT和MAPK/ERK通路促进胃肿瘤发生。
- 主要证据
- 在人BRG组织和小鼠DGR模型中观察到巨噬细胞焦亡和USP50升高；细胞实验证实USP50增强胆汁酸诱导的炎性小体激活；co-IP和泛素化实验证明USP50与ASC互作并去泛素化；功能实验表明巨噬细胞条件培养基促进胃癌细胞增殖和侵袭，且依赖HMGB1。
- 研究意义
- 揭示了USP50在胆汁反流相关胃癌发生中的新作用，可能为DGR相关GC的预防提供新靶点，HMGB1可能成为未来临床干预的靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞模型验证TDCA诱导巨噬细胞焦亡
验证胆汁酸能否在巨噬细胞中诱导NLRP3炎性小体激活和焦亡。
使用PMA分化的U937和RAW264.7细胞，以不同浓度和时间TDCA处理，检测焦亡相关蛋白表达。
验证USP50调控NLRP3炎性小体激活
确定USP50对胆汁酸诱导的NLRP3炎性小体激活的功能影响。
在巨噬细胞中过表达或敲低USP50，检测焦亡相关蛋白、IL-1β/IL-18分泌和GSDMD切割。
机制研究：USP50与ASC相互作用并去泛素化
阐明USP50如何调控NLRP3炎性小体激活的分子机制。
通过co-IP检测USP50与ASC的相互作用，评估ASC斑点形成和寡聚化，测定ASC泛素化水平及连接类型。
检测DAMPs释放
确定胆汁酸诱导焦亡过程中释放的关键DAMPs。
检测TDCA处理的巨噬细胞上清中HMGB1、HSP70、HSP90、S100A8、S100A9和ATP水平。
体外功能实验验证肿瘤恶性行为
评估巨噬细胞来源的HMGB1对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
收集TDCA处理的巨噬细胞条件培养基（CM），培养胃癌细胞SNU216和HGC27，使用CCK-8、Transwell和划痕实验检测细胞功能，并使用HMGB1中和抗体和rhHMGB1干预。
机制验证：PI3K/AKT和MAPK/ERK通路
验证HMGB1是否通过PI3K/AKT和MAPK/ERK通路促进胃癌恶性行为。
检测关键通路蛋白磷酸化水平，并使用特异性抑制剂阻断通路，观察对细胞功能的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分化 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | P1585 |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 药物处理 | 牛磺脱氧胆酸 | GLPBIO | GC44995 |
| 重组人HMGB1蛋白 | Abcam | ab285780 | |
| HMGB1中和抗体 | Abcam | ab79823 | |
| MG132 | Sigma-Aldrich | -- | |
| SCH772984 | Selleck | S7101 | |
| MK-2206 | Selleck | S1078 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| NcmBlot封闭液 | NCM Biotech | P30500 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Mishu Biotechnology | MI00607B | |
| USP50抗体 | Proteintech | 24817-1-AP | |
| NLRP3抗体 | Abcam | ab263899 | |
| Caspase-1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| GSDMD抗体 | CST | #97558 | |
| IL-1β抗体 | CST | #12242 | |
| IL-18抗体 | Proteintech | 10663-1-AP | |
| ASC抗体 | Abcam | ab309497 | |
| 泛素抗体 | Proteintech | 10201-2-AP | |
| p-AKT抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| ERK1/2抗体 | Abcam | ab184699 | |
| p-ERK1/2抗体 | CST | #4370S | |
| HMGB1抗体 | Abcam | ab18256 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Absin | abs20039 | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Absin | abs20040 | |
| ASC寡聚化实验 | DSS（辛二酸二琥珀酰亚胺酯） | Sigma-Aldrich | -- |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| ELISA | 人IL-18 ELISA试剂盒 | Abcam | ab215539 |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Abcam | ab216165 | |
| 人IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab214025 | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Abcam | ab197742 | |
| 小鼠S100A8 ELISA试剂盒 | Abcam | ab263886 | |
| 小鼠S100A9 ELISA试剂盒 | Abcam | ab213887 | |
| HSP70 ELISA试剂盒 | Abcam | ab133060 | |
| 人S100A8 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1289c | |
| 人S100A9 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1290c | |
| HSP90 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1864c | |
| 人HMGB-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1554c | |
| 小鼠HMGB-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0676c | |
| ATP检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP419 |
| 反转录 | 反转录试剂盒 | Accurate Biotechnology | AG11728 |
| qPCR | RealStar Fast SYBR qPCR Mix | GenStar | A301-5 |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫共沉淀 | Western和IP细胞裂解液 | Beyotime | P0013 |
| ANTI-FLAG抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| His抗体 | Abcam | ab18184 | |
| ASC斑点检测 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 细胞功能实验 | CCK-8试剂盒 | GLPBIO | GK10001 |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | BD | -- | |
| 染色 | 结晶紫 | -- | -- |
| 免疫组化/免疫荧光 | CD68抗体 | Servicebio | GB113150 |
| 免疫组化 | 数字切片扫描仪 | 3DHISTECH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本 | 患者诊断标准、样本类型和收集时间 阅读提示：见Materials and methods 2.1 Clinical specimen |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别、手术方式、饲养条件和观察时间 阅读提示：见Materials and methods 2.2 Mice and animal surgery |
| 细胞培养和分化 | 细胞系来源、培养基、FBS浓度、PMA浓度和时间、LPS浓度 阅读提示：见Materials and methods 2.3 Cell culture |
| 药物处理 | TDCA浓度和时间、DMSO溶解、rhHMGB1浓度、HMGB1 NAs浓度、抑制剂浓度 阅读提示：见Materials and methods 2.4 Drugs and reagents |
| Western blotting | 抗体信息（品牌、货号）、蛋白上样量、封闭液、ECL试剂 阅读提示：见Materials and methods 2.5 Western blotting |
| ASC泛素化实验 | 质粒构建、转染方法、MG132浓度和时间、IP抗体 阅读提示：见Materials and methods 2.6 Lentiviral transduction and plasmid construction 和2.9 co-IP |
| ELISA和ATP检测 | 检测试剂盒的具体型号和操作步骤 阅读提示：见Materials and methods 2.8 Measurement of ELISA and ATP |
| 细胞功能实验 | 细胞接种密度、CM制备、培养时间、观察时间点 阅读提示：见Materials and methods 2.12 CCK-8, 2.13 Transwell assay, 2.14 Scratch assay |