生物信息学分析及临床样本验证
探究IRE1α信号活性与黑色素瘤肿瘤浸润淋巴细胞特征及患者预后的相关性
利用TCGA SKCM数据库分析IRE1α信号特征评分与TIL评分的相关性；在31例黑色素瘤组织中进行免疫组化染色，分析XBP1与CD8α、IFN-γ的相关性。
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肿瘤细胞IRE1α促进CD8+T细胞依赖性抗肿瘤免疫并提高黑色素瘤免疫治疗效果
Tumorous IRE1α facilitates CD8+T cells-dependent anti-tumor immunity and improves immunotherapy efficacy in melanoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验、共培养杀伤实验、小鼠移植瘤模型及临床样本分析等多个独立证据层级，并进行了机制验证。
主要模型
B16F10小鼠黑色素瘤细胞移植瘤模型 A2058和A375人黑色素瘤细胞系 TCGA SKCM数据库队列 31例黑色素瘤组织样本
重点核对
HA15给药剂量：0.7 mg/小鼠/天，腹腔注射，从接种后第7天开始连续9天 CD8+T细胞清除：抗CD8α抗体（100 µg/小鼠）在肿瘤接种前2天和1天及此后每2天腹腔注射 体外ER应激诱导：HA15 10 µM处理24小时 IRE1α抑制剂：STF-083010 10 µM或MKC8866 0.5 µM预处理24小时 NF-κB抑制剂：BAY-11-7085 1 µM预处理24小时
摘要
背景：肿瘤细胞经常遭受内质网应激。以往研究已广泛阐明肿瘤未折叠蛋白反应在黑色素瘤细胞中的作用，但其对肿瘤免疫学的影响及潜在机制仍不清楚。方法：采用生物信息学、生物化学检测和临床前小鼠模型来证明肿瘤肌醇需求酶1α（IRE1α）在抗肿瘤免疫中的作用及潜在机制。结果：我们首先发现IRE1α信号激活与肿瘤浸润淋巴细胞特征呈正相关。随后，通过HA15药物诱导内质网应激，在免疫功能正常的小鼠中产生了显著的抗肿瘤效果，并且高度依赖CD8+T细胞，同时伴随肿瘤微环境中免疫细胞的重塑，这一过程依赖于肿瘤IRE1α-XBP1信号。接着，肿瘤IRE1α通过XBP1-NF-κB轴促进多种趋化因子和细胞因子的表达和分泌，导致CD8+T细胞浸润增加和抗肿瘤能力增强。最后，在体内黑色素瘤模型中，通过HA15药物诱导肿瘤内质网应激与抗PD-1抗体联合治疗增强了治疗效果。结论：肿瘤IRE1α通过XBP1-NF-κB轴调节趋化因子和细胞因子，促进CD8+T细胞依赖性抗肿瘤免疫并提高免疫治疗效果。内质网应激诱导剂与抗PD-1抗体的联合治疗有望提高黑色素瘤免疫治疗的疗效。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤细胞中的内质网应激通过IRE1α信号通路是否以及如何调节抗肿瘤免疫？
- 核心机制
- 肿瘤IRE1α激活后通过XBP1和NF-κB轴促进Th1相关趋化因子（CXCL9、CXCL10、CXCL11）和细胞因子（IL-6、TNF-α）的表达和分泌，从而增强CD8+T细胞的浸润和抗肿瘤功能。
- 主要证据
- TCGA SKCM数据库分析显示IRE1α活性与TIL评分正相关；HA15诱导内质网应激在免疫活性小鼠中抑制B16F10肿瘤生长，且高度依赖CD8+T细胞；IRE1α或XBP1敲低逆转HA15效应；体外共培养实验显示HA15预处理的黑色素瘤细胞增强CD8+T细胞杀伤能力，抑制IRE1α或NF-κB可逆转。
- 研究意义
- 该研究为内质网应激诱导剂联合抗PD-1抗体作为提高黑色素瘤免疫治疗疗效的潜在策略提供了依据，表明药物诱导肿瘤内质网应激是一种有价值的增强肿瘤免疫的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证ER应激对黑色素瘤细胞的影响
验证ER应激诱导剂HA15和TG对黑色素瘤细胞活力及IRE1α信号激活的作用
用CCK8检测细胞活力，Western blot检测p-IRE1α、XBP1s等蛋白表达。
体内验证HA15的抗肿瘤效应及CD8+T细胞依赖性
评估HA15在免疫活性小鼠中的抗肿瘤效果，并验证其对CD8+T细胞的依赖性
B16F10细胞皮下接种C57BL/6小鼠，给予HA15或对照处理，测量肿瘤体积和重量；流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞；CD8抗体清除实验验证依赖性。
机制探究：IRE1α-XBP1-NF-κB轴对趋化因子和细胞因子的调控
阐明IRE1α激活如何促进趋化因子和细胞因子的表达和分泌
用TG或HA15处理黑色素瘤细胞，检测CXCL9、CXCL10、CXCL11、IL-6、TNF-α的转录和分泌水平；使用IRE1α抑制剂、NF-κB抑制剂或敲低IRE1α/XBP1/RIG-1进行干预；ChIP实验验证转录因子结合。
共培养验证CD8+T细胞杀伤增强
验证HA15预处理的黑色素瘤细胞增强CD8+T细胞的活化和杀伤能力
将PBMC来源的活化T细胞与HA15预处理的黑色素瘤细胞共培养，检测肿瘤细胞存活率和CD8+T细胞活化标志（CD69、Granzyme B、IFN-γ）。
体内联合治疗评估
评估HA15与抗PD-1抗体联合治疗对黑色素瘤生长的抑制作用
B16F10皮下移植瘤模型，单独或联合给予HA15和抗PD-1抗体，测量肿瘤体积和重量，流式分析肿瘤浸润免疫细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 毒胡萝卜素 | MCE | HY-13,433 |
| HA15 | MCE | HY-100,437 | |
| 玉米油 | MCE | HY-Y1888 | |
| STF-083010 | MCE | HY-15,845 | |
| MKC8866 | MCE | HY-15,845 | |
| BAY-11-7085 | MCE | HY-10,257 | |
| 动物实验 | 抗PD-1抗体 | BioXCell | BE0146 |
| IgG同型对照 | BioXCell | BE0083 | |
| 抗CD8α抗体 | BioXCell | BE0117 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | P0013C |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | NCM biotech | P002 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| Immobilon-P PVDF膜 | MilliporeSigma | IPVH00010 | |
| Spectra多色宽范围蛋白分子量标准 | Fermentas | 26,617 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-003 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | |
| Pierce快速Western blot试剂盒，ECL底物 | Thermo Fisher Scientific | 35,055 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15,596,018 |
| PrimeScript逆转录预混液 | TaKaRa | RR036A | |
| SYBR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820A | |
| Bio-Rad多色实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad Laboratories | iQTM5 | |
| ELISA | 人IL-6 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC007.96 |
| 人TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC103a.96 | |
| 人MIG/CXCL9 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC114.96 | |
| 人IP-10/CXCL10 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC157.96 | |
| 人I-TAC/CXCL11 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC084.96 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0002 | |
| 小鼠IL-2 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-MSEL-M0036 | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0044c | |
| 小鼠MIG/CXCL9 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M3077 | |
| 小鼠IP-10/CXCL10 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0021c | |
| 小鼠I-TAC/CXCL11 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0056c | |
| 小鼠HMGB-1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-M0676c | |
| 流式细胞术 | PE标记的抗人CD274抗体 | Biolegend | #329706 |
| Zombie染料 | Biolegend | #423108 | |
| APC标记的抗人CD3抗体 | Biolegend | #300312 | |
| PE-cy7标记的抗人CD8α抗体 | Biolegend | #344750 | |
| FITC标记的抗人CD69抗体 | Biolegend | #310904 | |
| 转录因子缓冲液套装 | Biolegend | #424401 | |
| PE标记的抗人/小鼠颗粒酶B抗体 | Biolegend | #372208 | |
| Pacific Blue标记的抗人IFN-γ抗体 | Biolegend | #502522 | |
| 含布雷菲德菌素A的细胞活化混合物 | Biolegend | #423304 | |
| 抗小鼠Fc阻断抗体 | Biolegend | #101320 | |
| Zombie UV™可固定活力检测试剂盒 | Biolegend | #423108 | |
| True-Nuclear™转录因子缓冲液套装 | Biolegend | #424401 | |
| BD LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| BD FACS Diva软件 | BD Bioscience | Version 7 | |
| 共培养实验 | ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞活化剂 | STEMCELL Technologies | 10,970 |
| 重组人IL-2 | R&D | 202-1L-050 | |
| 抗CD3ε单克隆抗体 | eBioscience | 16-0037 | |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | Tissue Tek, Sakura | -- |
| 大鼠抗CD8α单克隆抗体 | abcam | ab22378 | |
| 山羊抗大鼠IgG H&L（FITC） | Zhuangzhibio | EK041 | |
| DAPI | Roche | -- | |
| 兔抗XBP1s多克隆抗体 | proteintech | 24868-1-AP | |
| 兔抗Annexin A1多克隆抗体 | proteintech | 21990-1-AP | |
| 兔抗Calreticulin多克隆抗体 | proteintech | 27298-1-AP | |
| 兔抗HMGB1多克隆抗体 | proteintech | 10829-1-AP | |
| 兔抗p-MLKL (Ser345)单克隆抗体 | CST | 37,333 | |
| 小鼠抗Foxp3单克隆抗体 | proteintech | 65089-1-Ig | |
| CoraLite® Plus 488大鼠抗CD4单克隆抗体 | proteintech | CL488-65141 | |
| 兔抗颗粒酶B多克隆抗体 | proteintech | 13588-1-AP | |
| 兔抗IFN-γ多克隆抗体 | Sinobiological | 105,995-T08 | |
| 大鼠抗CD8α单克隆抗体 | proteintech | 65069-1-Ig | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Cy3） | Zhuangzhibio | EK022 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（FITC） | Zhuangzhibio | EK023 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3） | Zhuangzhibio | EK012 | |
| 流式细胞术 | FALCON细胞筛网 | Corning | -- |
| 数据分析 | FlowJo软件 | Treestar Inc | V10 |
| GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | 9.0 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度、培养条件 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents |
| 体外药物处理 | 药物浓度（HA15 10 µM、TG浓度、STF-083010 10 µM、MKC8866 0.5 µM、BAY-11-7085 1 µM）、处理时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents; Figure legends |
| 动物模型 | 小鼠品系（C57BL/6）、性别（雌性）、年龄（约6周）、肿瘤细胞接种量（5×10^5）、接种部位（右侧后腹）、HA15给药剂量和方案（0.7 mg/小鼠/天，腹腔注射，第7天起连续9天） 阅读提示：Materials and methods: Animal models |
| CD8+T细胞清除 | 抗CD8α抗体剂量（100 µg/小鼠）、给药时间（接种前2天和1天及此后每2天） 阅读提示：Materials and methods: In vivo depletion of CD8+T cells |
| 共培养杀伤实验 | T细胞与肿瘤细胞比例（1:3）、共培养时间（24小时）、活化T细胞制备条件 阅读提示：Materials and methods: T cell-mediated tumor cell killing assay |
| 流式细胞术分析 | 抗体克隆、荧光标记、固定破膜方法 阅读提示：Materials and methods: Analysis of tumor-infiltrating immune cells by flow cytometry; Additional file 2: Table 2 |
| 联合治疗 | HA15给药剂量、抗PD-1抗体剂量（100 µg/小鼠/3天）、治疗时间窗口 阅读提示：Materials and methods: Animal models; Figure 6 legend |