临床样本PD-L1表达检测
评估PD-L1在尖锐湿疣疣体与正常包皮中的表达差异。
收集尖锐湿疣患者疣体组织和健康人包皮组织,进行免疫组化染色、qRT-PCR、Western blot和双色免疫荧光检测PD-L1表达及定位。
The expression and significance of PD-L1 in condyloma acuminatum.
包含临床组织样本检测(免疫组化、qPCR、Western blot、免疫荧光)和体外细胞模型(HPV11-E7 HaCaT与Jurkat共培养)两个证据层级,但缺乏体内动物模型。
尖锐湿疣患者疣体组织 健康人包皮组织 HaCaT细胞(HPV11-E7稳定转染) Jurkat细胞
临床样本:20例尖锐湿疣疣体组织与20例健康包皮组织 HPV11-E7慢病毒转染HaCaT细胞(MOI=10) 共培养条件:2.5×10^5 HaCaT细胞与5×10^5 Jurkat细胞共培养24小时 PD-L1阻断:抗PD-L1抗体(329716, BioLegend)处理4小时 检测指标:PD-L1表达、Jurkat细胞凋亡、增殖和细胞周期
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估PD-L1在尖锐湿疣疣体与正常包皮中的表达差异。
收集尖锐湿疣患者疣体组织和健康人包皮组织,进行免疫组化染色、qRT-PCR、Western blot和双色免疫荧光检测PD-L1表达及定位。
验证HPV11-E7是否能上调HaCaT细胞中PD-L1的表达。
使用携带HPV11-E7基因的慢病毒转染HaCaT细胞,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,Western blot和RT-qPCR验证PD-L1表达。
探究HPV感染角质形成细胞是否通过PD-1/PD-L1通路影响Jurkat细胞凋亡、增殖和细胞周期。
将HPV11-E7 HaCaT细胞与PHA活化的Jurkat细胞共培养,使用抗PD-L1抗体阻断,流式细胞术检测凋亡和周期,CCK-8检测增殖。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 免疫组化/免疫荧光 | PD-L1抗体 | Proteintech | 66248-1-Ig |
| 免疫荧光 | K10抗体 | Elabscience | E-AB-31137 |
| RT-qPCR | 逆转录试剂盒 | Yeasen | 11123ES |
| RT-qPCR试剂盒 | Yeasen | 11195ES | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| Western blot | 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC026 |
| 抗DDDDK标签抗体 | ABclonal | AC005 | |
| 细胞模型构建 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | 556547 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | KeyGen Biotech | KGA511 |
| 共培养阻断 | 抗PD-L1抗体 | BioLegend | 329716 |
| 细胞培养 | 植物血凝素 | -- | -- |
| 流式分析 | Accuri C6流式细胞仪 | BD | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | 样本量和来源:20例尖锐湿疣患者疣体组织与20例健康人包皮组织;患者需符合HPV6/11阳性、病程≥3个月、年龄18-60岁等标准。 阅读提示:Methods 2.2 Study subjects |
| PD-L1表达检测 | 抗体:抗PD-L1(66248-1-Ig, Proteintech),抗K10(E-AB-31137, Elabscience);免疫组化/荧光染色步骤(如抗原修复、抗体孵育时间)。 阅读提示:Methods 2.4 Immunohistochemical staining, 2.5 Immunofluorescence |
| 细胞模型构建 | 慢病毒MOI=10,嘌呤霉素筛选浓度1 μg/mL,筛选时间1周;验证方法Western blot和RT-qPCR。 阅读提示:Methods 2.8 Building the cell model |
| 共培养实验 | Jurkat细胞活化(PHA 5 μg/mL, 48h);共培养比例(凋亡/周期:2.5×10^5 HaCaT + 5×10^5 Jurkat;增殖:5×10^3 HaCaT + 1×10^4 Jurkat);共培养时间(24h,增殖检测1,2,3天);抗PD-L1抗体(329716, BioLegend)预处理4小时。 阅读提示:Methods 2.9, 2.10, Results 3.3, 3.4 |