scRNA-seq识别EndoMT中间体
通过单细胞转录组分析，鉴定骨髓中可能发生EndoMT的细胞亚群
对5周龄野生型小鼠的胶原酶消化骨和骨髓细胞进行scRNA-seq，获得5554个非造血细胞，包括ECs和多种基质细胞亚群，分析内皮和间充质标记表达。
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重新评估小鼠骨髓中的内皮-间质转化：谱系追踪模型的见解
Reassessing endothelial-to-mesenchymal transition in mouse bone marrow: insights from lineage tracing models.
实验完整度
高包含scRNA-seq、遗传谱系追踪、流式、免疫染色、RNA-ISH和5-FU处理等独立证据层级，并进行了功能验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠 Prrx1-Cre;R26T和Lepr-Cre;R26T转基因小鼠 Cdh5-tetO-Cre;R26T和Tek-CreERT2;R26T转基因小鼠 体外培养的BMSCs和ECs
重点核对
谱系追踪效率：Cdh5和Tek Cre模型对骨髓ECs的标记效率需验证（>90%） Tamoxifen给药方案：75 mg/kg体重，连续5天腹腔注射 Doxycycline给药方案：饮水含0.2g/100mL，连续5天（幼鼠）或4天（孕鼠） 5-FU剂量：150 mg/kg体重，单次腹腔注射 BMSC培养条件：αMEM+15% FBS，培养至少2代
摘要
内皮细胞（ECs）和骨髓基质细胞（BMSCs）在支持造血和造血再生中发挥关键作用。然而，ECs是否是BMSCs的来源仍不清楚。在此，我们评估了内皮-间质转化对出生后小鼠BMSCs生成的贡献。单细胞RNA测序鉴定了表达BMSC标记物Prrx1和Lepr的ECs；然而，这无法通过Prrx1-Cre和Lepr-Cre转基因小鼠进行验证。此外，只有少数BMSCs被使用Cdh5-rtTA-tetO-Cre或Tek-CreERT2的EC谱系追踪模型标记。而且，Cdh5+ BMSCs和Tek+ BMSCs表现出不同的空间分布和特征性间充质标记，提示它们来源于不同的祖细胞而非CDH5+ TEK+ ECs。此外，由5-氟尿嘧啶处理诱导的髓系清除并未增加Cdh5+ BMSCs。我们的研究结果表明，在稳态和髓系清除诱导的造血再生期间，ECs几乎不转化为BMSCs，强调在使用适当的遗传模型和进行仔细的数据解释时对于内皮-间质转化研究的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 出生后小鼠骨髓中，内皮细胞（ECs）是否通过内皮-间质转化（EndoMT）成为骨髓基质细胞（BMSCs）的来源？
- 核心机制
- ECs在稳态和髓系清除诱导的再生中不转化为BMSCs；先前报道的ECs表达间充质标记物主要由EC-BMSC异型双细胞造成。
- 主要证据
- scRNA-seq显示ECs表达Prrx1/Lepr，但Prrx1-Cre和Lepr-Cre系未标记ECs；EC谱系追踪仅标记少数BMSCs，且Cdh5+和Tek+ BMSCs分布和标记不同；5-FU处理后Cdh5+ BMSCs未增加。
- 研究意义
- 强调在EndoMT研究中，需要谨慎选择遗传模型并仔细解释数据，以避免假阳性结果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
遗传谱系追踪验证Prrx1+和Lepr+ ECs
验证scRNA-seq中发现的Prrx1+ ECs和Lepr+ ECs是否真实存在
将Prrx1-Cre和Lepr-Cre与Rosa26-LSL-tdTomato杂交，通过免疫染色和流式检测Tomato+ ECs，并分析scRNA-seq中的双细胞率。
EC谱系追踪标记BMSCs
评估Cdh5和Tek谱系追踪模型标记的BMSCs比例
使用Cdh5-rtTA-tetO-Cre和Tek-CreERT2模型，在P21-P25诱导后，通过流式和免疫染色检测BMSCs中Tomato+细胞比例，并进行体外分化实验。
分析Cdh5+和Tek+ BMSCs的空间分布
确定Cdh5+和Tek+ BMSCs是否来自ECs
通过免疫染色观察胫骨/股骨切片中Tomato+细胞的位置和形态，并追踪2个月后的分布变化。
评估EMCN+ SMCs/PCs和EMCN+ BMSCs
检查EMCN+细胞是否具有内皮起源
免疫染色检测αSMA+细胞中EMCN表达；通过MACS/FACS分离EMCN+ BMSCs，分析其分化能力和内皮标记表达，并检测Cdh5-tetO-Cre标记。
5-FU处理后检测BMSCs的变化
验证髓系清除后ECs是否增加BMSCs的生成
对Cdh5-tetO-Cre;R26T小鼠给予5-FU，在不同时间点流式检测BMSCs中Tomato+细胞比例，并补充额外doxycycline处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 多西环素 | MCE | HY-N0565B | |
| 5-氟尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | F6627 | |
| 细胞培养 | αMEM培养基 | Gibco | 12664-025 |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| II型胶原酶 | Gibco | 17101015 | |
| 中性蛋白酶II | Sigma-Aldrich | 04942078001 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| I型胶原 | BD Biosciences | 354236 | |
| 内皮生长培养基 | Lonza | CC-3202 | |
| Accutase消化液 | Gibco | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | FACSCanto II流式细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| Aurora流式细胞分析仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| Zombie Aqua染料 | Biolegend | 423101 | |
| CD16/32抗体 | Biolegend | 101320 | |
| CD31-BV711抗体 | Biolegend | 303136 | |
| EMCN-AF488/eFluor660抗体 | eBioscience | 50-5851-82/53-5851-82 | |
| TIE2-APC抗体 | eBioscience | 17-5987-82 | |
| CDH5-BV421抗体 | BD OptiBuild | 747749 | |
| PDGFRα-APC/BV421抗体 | BD Pharmingen | 562777/562774 | |
| CD51-APC抗体 | Elabscience | E-AB-F1235E | |
| Sca-1抗体 | Biolegend | 108111 | |
| CD29-APC抗体 | Biolegend | 102215 | |
| CD45-PercpCy5.5/APC-CY7抗体 | BD Pharmingen | 550994/557659 | |
| 谱系混合抗体 | BD Pharmingen | 561317 | |
| CD71-PercpCy5.5抗体 | BD Pharmingen | 562858 | |
| CD19-APC抗体 | eBioscience | 17-0193-80 | |
| CD3-APC抗体 | Cell Signaling Technology | 24265s | |
| Ly-6G-APC抗体 | BD Pharmingen | 560599 | |
| CD11b-FITC抗体 | BD Pharmingen | 557396 | |
| 同型对照抗体 | Biolegend/BD Horizon/eBioscience | -- | |
| MACS分选 | 抗PE磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 |
| 谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-858 | |
| 免疫染色 | CD31抗体 | Abcam | ab28364 |
| CD31抗体（FAB3628G） | R&D Systems | FAB3628G | |
| Endomucin抗体 | Santa Cruz | sc-65495 | |
| α平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab124964 | |
| CD45抗体 | BD Pharmingen | 557659 | |
| RUNX2抗体 | Cell Signaling Technology | 12556S | |
| 二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| RNAscope | RNAscope多通道荧光试剂盒v2 | ACD | -- |
| Prrx1探针 | ACD | 485231-C2 | |
| Lepr探针 | ACD | 471171 | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶珠试剂盒v3.1 | 10x Genomics | 1000121 |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| Cell Ranger软件 | 10x Genomics | -- | |
| 免疫染色 | DAPI | Vector | -- |
| 细胞处理 | SV40T抗原慢病毒 | Shanghai GeneChem Co., Ltd. | -- |
| 细胞培养 | EMCN-PE抗体 | Santa Cruz | sc-65495 |
| EMCN-PE抗体（eBioscience） | eBioscience | 12-5851-82 | |
| 红细胞裂解液 | ThermoFisher Scientific | A1049201 | |
| RNAscope | opal570和opal690染料 | 文中未明确说明 | -- |
| 切片 | O.C.T.包埋剂 | 文中未明确说明 | -- |
| 快速脱钙缓冲液 | Beijing Pursuit Bio Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 鼠龄、性别、品系；给药方式、剂量和时间；对照组设置。 阅读提示：Methods: Animal experiments and genetically modified mice |
| BMSC培养 | 培养基组成、培养时长、传代次数、消化酶和消化条件。 阅读提示：Methods: Isolation and culture of BMSCs |
| EC培养 | 消化酶、培养条件（EGM）、胶原包被。 阅读提示：Methods: Isolation and culture of bone marrow ECs |
| scRNA-seq | 样本制备、质控标准、基因筛选、双细胞去除方法。 阅读提示：Methods: Single-cell RNA sequencing and analysis |
| 免疫染色 | 固定、脱钙、切片厚度、抗体稀释倍数。 阅读提示：Methods: Immunofluorescence assay and image acquisition |
| 5-FU处理 | 给药剂量、时间点、细胞计数。 阅读提示：Results: No increase in EC marker-expressing BMSCs post myeloablation |