抗体筛选与体外表征
从免疫供体中分离出能广谱中和SARS-CoV-2变体的单克隆抗体8-9D。
通过FACS分选RBD特异性记忆B细胞，获得118个单克隆抗体，并鉴定出8-9D具有广谱中和活性。通过BLI测定其与不同RBD的结合亲和力，并通过竞争实验判断其阻断ACE2结合的能力。
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一种肺选择性递送编码针对SARS-CoV-2感染的广泛中和抗体的mRNA
A lung-selective delivery of mRNA encoding broadly neutralizing antibody against SARS-CoV-2 infection.
实验完整度
高包含体外中和实验、结构生物学（冷冻电镜）、体内小鼠模型（K18-hACE2）验证，以及LNP递送系统表征，多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 Vero细胞 K18-hACE2转基因小鼠 C57BL/6小鼠
重点核对
8-9D mRNA的LNP制剂（Lung-LNPs vs Liver-LNPs） 小鼠品系（K18-hACE2）和性别（雌性） SARS-CoV-2攻击剂量与毒株（Beta、Omicron BA.2，2×10^4 TCID50） 给药剂量（5μg mRNA）和时间（攻击前24小时） 病毒载量检测（qRT-PCR）和组织病理学评估
摘要
呼吸系统，尤其是肺，是SARS-CoV-2感染引起的病理损伤的关键部位。鉴于通过静脉给药将抗体靶向递送到肺部的可行性较低，以及通过鼻内或雾化免疫使抗体在肺部的半衰期较短，编码具有肺靶向能力的广泛中和抗体的mRNA可以完美地在肺部提供高滴度的抗体，以预防SARS-CoV-2感染。在此，我们首先鉴定了一种人单克隆抗体8-9D，它对SARS-CoV-2变体具有广泛的中和能力。该抗体的中和机制通过8-9D Fab与Omicron BA.5刺突蛋白复合物的结构特征得以解释。此外，我们使用安全且稳健的mRNA递送平台评估了8-9D的功效，并比较了8-9D的mRNA选择性递送到肺部与未选择性递送时的性能。8-9D mRNA的肺选择性递送使得中和抗体在肺部表达，从而阻断病毒入侵，有效保护雌性K18-hACE2转基因小鼠免受Beta或Omicron BA.1变体的攻击。我们的工作强调了肺选择性mRNA抗体在预防和治疗由流行SARS-CoV-2变体引起的感染中的潜在应用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究肺选择性递送编码广泛中和抗体的mRNA是否能有效预防和治疗SARS-CoV-2感染。
- 核心机制
- 8-9D抗体通过阻断RBD与ACE2结合，并利用肺选择性LNP实现肺部原位表达，从而在感染部位提供高浓度中和抗体，阻断病毒入侵。
- 主要证据
- 体外中和实验显示8-9D对多种变体有效；冷冻电镜结构揭示了中和机制；小鼠模型中，Lung-LNPs@mRNA8-9D预防和治疗均显著降低病毒载量并减轻肺部病理。
- 研究意义
- 肺选择性mRNA抗体为SARS-CoV-2及其他呼吸道病毒感染的预防和治疗提供了有前景的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结构解析中和机制
阐明8-9D广谱中和活性的结构基础。
通过冷冻电镜解析了8-9D Fab与Omicron BA.5刺突蛋白复合物的结构，分析了表位特征、氢键网络以及与ACE2结合位点的重叠情况。
开发肺选择性LNP递送系统
构建能特异性地将mRNA递送到肺部的LNP系统，并验证其器官选择性。
合成了可电离脂质和靶向脂质，制备了Lung-LNPs和Liver-LNPs，并测试了负载荧光素酶或eGFP mRNA后的粒径、电荷、稳定性以及在体内的分布。
评估mRNA-LNP在体外和体内的表达
验证8-9D mRNA在体外细胞和体内小鼠中的表达，并评估其引起的免疫反应。
在HEK293T细胞中验证了8-9D mRNA的表达，并通过Western blot和免疫荧光检测。在C57BL/6小鼠中注射LNP包裹的mRNA后，检测了血清、BALF、肺和肝脏中的抗体水平，并分析了细胞因子水平和肺内免疫细胞浸润。
小鼠模型中的保护效果评估
评估肺选择性递送8-9D mRNA对SARS-CoV-2感染的预防和治疗效果。
使用K18-hACE2转基因小鼠，在感染前或感染后24小时静脉注射LNP包裹的8-9D mRNA，然后进行SARS-CoV-2攻击，检测病毒载量和肺部病理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体筛选 | Ficoll密度梯度分离液 | GE Healthcare | 17144002 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SH30084.03 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma | D2650-100ML | |
| 假病毒中和试验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | 11668-019 |
| Bright-Lite荧光素酶检测系统 | Vazyme | DD1204 | |
| 活病毒中和试验 | Vero细胞 | ATCC | CCL-81 |
| 抗体筛选 | 泛B细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-101-638 |
| 生物素化的SARS-CoV-2刺突蛋白RBD | Acro Biosystems | SPD-C82E9 | |
| Human TruStain FcX Fc受体阻断剂 | Biolegend | 422302 | |
| 抗CD19-FITC抗体 | Biolegend | 363008 | |
| 抗CD3-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 300431 | |
| 抗CD8-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 301023 | |
| 抗CD14-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 325616 | |
| 抗CD27-PerCP/Cyanine5.5抗体 | Biolegend | 356408 | |
| 链霉亲和素-APC | Biolegend | 405207 | |
| 链霉亲和素-PE | Biolegend | 405203 | |
| RNase抑制剂 | New England Biolabs | M0314L | |
| 抗体克隆 | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 |
| 抗体表达 | HEK293F细胞 | Thermo Fisher Scientific | R79007 |
| 蛋白G琼脂糖珠柱 | Solarbio | R8300 | |
| BLI | 链霉亲和素生物传感器 | Molecular Devices | 18-5019 |
| PBS缓冲液 | Gibco | C10010500BT | |
| 人ACE2受体 | Sino Biological | 10108 | |
| 蛋白A生物传感器 | Octet | MSPP-185012 | |
| 蛋白表达与纯化 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 24765 |
| 木瓜蛋白酶 | Sigma | P3125 | |
| Superose 6 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| 冷冻电镜 | Quantifoil碳膜微栅 | Quantifoil | -- |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher | -- | |
| Titan Krios电子显微镜 | FEI Company | -- | |
| mRNA合成 | ScriptCap Cap 1加帽系统 | CELLSCRIPT | C-SCCS1710 |
| DNase I | Takara | -- | |
| SDS-PAGE和Western blot | TransIT-mRNA转染试剂 | Mirus Bio | MIR-2250 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 | |
| 抗Flag标签兔单抗（HRP） | Proteintech | HRP-66008 | |
| 抗V5标签小鼠单抗 | GenScript | A01733 | |
| 脂质合成 | 油酸 | 文中未明确说明 | -- |
| LNP递送 | D-荧光素 | Yeasen | 40901ES01 |
| ELISA | HRP标记的抗人IgG | Invitrogen | A18817 |
| LNP表征 | Zetasizer Nano-ZS90粒度仪 | Malvern Instruments | -- |
| Hitachi HT-7700透射电镜 | Hitachi | -- | |
| 流式细胞术 | 可固定活力染料eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 |
| 抗EpCAM抗体 | Biolegend | 118214 | |
| 抗CD45抗体 | Biolegend | 157605 | |
| 抗CD31抗体 | Biolegend | 102409 | |
| 细胞因子检测 | LEGENDplex多因子检测试剂盒 | Biolegend | 740446 |
| 免疫细胞分析 | LIVE/DEAD Ghost染料UV 450 | Tonbo Biosciences | 13-0868-T500 |
| 抗CD45-AF700抗体 | Invitrogen | 56-0451-82 | |
| 抗CD11c-AF488抗体 | Biolegend | 117313 | |
| 抗CD11b-Pacific Blue抗体 | Biolegend | 101223 | |
| 抗CD24-PE/Cyanine7抗体 | Elabscience | E-AB-F1179UH | |
| 抗CD64-PE抗体 | Elabscience | E-AB-F1186UD | |
| 抗I-A/I-E-AF647抗体 | Biolegend | 107618 | |
| 免疫荧光 | 抗Flag标签兔单抗 | Proteintech | 80010-1-RR |
| 抗V5标签小鼠单抗 | Invitrogen | 37-7500 | |
| Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG（H+L） | Invitrogen | A-11001 | |
| Alexa Fluor 594标记的抗兔IgG（H+L） | Invitrogen | A-21207 | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 临床化学分析 | Idexx VetTest 8008生化分析仪 | Idexx Laboratories | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism统计软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LNP制备与表征 | Lung-LNPs和Liver-LNPs的脂质组成，mRNA与脂质的比例（40:1），水相与乙醇比例（3:1），粒径与zeta电位 阅读提示：参见Methods中'Lipid nanoparticle preparation'和'LNPs characterization'，以及图3d-h |
| 抗体中和活性评估 | 假病毒中和试验中的起始抗体浓度和稀释倍数，活病毒中和试验中的病毒株和TCID50，细胞类型和培养条件 阅读提示：参见Methods中'Pseudovirus neutralization assay'和'Live SARS-CoV-2 neutralization'，图1e-h |
| 体内表达与分布 | 小鼠品系和体重（C57BL/6，20-22g），mRNA剂量（5μg），给药途径（静脉注射），检测时间点（24h、2h、6h等） 阅读提示：参见Methods中'Luciferase or eGFP mRNA delivery'，图3i-m |
| 小鼠保护实验 | K18-hACE2小鼠的年龄和性别（雌性，4-6周），攻击病毒株和剂量（Beta或Omicron BA.2，2x10^4 TCID50），给药时间（预防组攻击前24h，治疗组感染后24h），剂量（5μg），安乐死时间（感染后4天） 阅读提示：参见Methods中'SARS-CoV-2 challenge'，图5a-f |