小鼠模型验证HDAC1对性成熟的影响
探究组蛋白去乙酰化酶抑制对小鼠卵泡发育和性成熟的影响。
对3周龄C57BL/6J小鼠腹腔注射TSA（0.5 mg/kg）或DMSO，每周3次，持续3周；观察阴道开口时间，检测血清激素水平、卵巢组织学变化、颗粒细胞凋亡及Hdac1蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HDAC1介导的长链非编码RNA卵泡发育刺激因子通过miR-202-3p-COX1轴抑制颗粒细胞凋亡并调控性成熟
HDAC1-Mediated lncRNA Stimulatory Factor of Follicular Development to Inhibit the Apoptosis of Granulosa Cells and Regulate Sexual Maturity through miR-202-3p-COX1 Axis.
实验完整度
高包含小鼠体内模型（TSA处理、慢病毒注射）和猪颗粒细胞体外模型，涵盖表观遗传（ChIP）、分子互作（双荧光素酶、RNA pull-down）、细胞功能（EdU、流式、ELISA）及组织学验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠模型 猪原代颗粒细胞
重点核对
TSA处理浓度0.5 mg/kg，每周3次，连续3周 HDAC1-siRNA2用于敲低HDAC1 SFFD过表达和敲低慢病毒（LV-lnc SFFD和sh-lnc SFFD）每次1×10^7 TU，每周1次，连续3周 GDF9（100 ng/mL）和BMP15（50 ng/mL）处理颗粒细胞24小时
摘要
异常性成熟对成人健康结局有显著不利影响，既往研究表明靶向组蛋白乙酰化可能是调控性成熟的潜在治疗策略。然而，其机制仍有待进一步阐明。利用小鼠模型，我们发现组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂曲古抑菌素A（TSA）下调卵巢中Hdac1蛋白水平，促进颗粒细胞（GCs）凋亡，从而阻滞卵泡发育并延缓性成熟。以猪颗粒细胞为细胞模型，通过RNA测序鉴定到一个新的性成熟相关lncRNA，命名为卵泡发育刺激因子（SFFD），该lncRNA由线粒体转录且受HDAC1介导。机制上，HDAC1敲低显著降低SFFD启动子-953/−661区域的H3K27ac水平，从而表观遗传抑制其转录。SFFD敲低释放miR-202-3p，降低环氧合酶1（COX1）的表达，COX1是前列腺素合成中的关键限速酶。这种降低抑制了颗粒细胞的增殖和17β-雌二醇（E2）的分泌，同时促进颗粒细胞凋亡。因此，卵泡发育被阻滞，性成熟被延迟。综上所述，HDAC1敲低介导的SFFD下调通过miR-202-3p-COX1轴促进颗粒细胞凋亡并导致性成熟延迟。我们的发现揭示了一个由HDAC1调控的新调控网络，HDAC1介导的SFFD可能是治疗性成熟延迟的有前景的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 组蛋白乙酰化如何通过调控颗粒细胞功能影响卵泡发育和性成熟？其分子机制是什么？
- 核心机制
- HDAC1敲低降低SFFD启动子-953/−661区域H3K27ac水平，表观抑制SFFD转录；SFFD作为ceRNA海绵吸附miR-202-3p，上调COX1表达，促进颗粒细胞增殖和E2分泌，抑制凋亡，从而促进卵泡发育和性成熟。
- 主要证据
- 小鼠TSA处理实验证实Hdac1下调延迟性成熟并促进颗粒细胞凋亡；猪颗粒细胞中RNA-seq、ChIP、双荧光素酶和功能实验验证了HDAC1-SFFD-miR-202-3p-COX1轴的作用；体内慢病毒介导的SFFD敲低小鼠模型显示卵泡发育阻滞和性成熟延迟。
- 研究意义
- 揭示了HDAC1介导的SFFD调控网络，提示SFFD可能是治疗性成熟延迟的潜在分子靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
猪颗粒细胞中验证HDAC1的功能
验证HDAC1对颗粒细胞增殖、凋亡和雌激素分泌的影响。
用TSA或HDAC1-siRNA处理猪原代颗粒细胞，检测细胞活力、增殖（EdU）、凋亡（流式、Caspase 3/7活性）及相关基因表达。
鉴定HDAC1介导的SFFD及其表观调控机制
鉴定HDAC1下游的lncRNA SFFD，并探究HDAC1调控其转录的表观机制。
对HDAC1-siRNA处理的颗粒细胞进行RNA-seq，筛选差异lncRNA；通过RACE确定SFFD全长，ChIP检测SFFD启动子区H3K27ac富集。
验证SFFD与miR-202-3p及COX1的靶向关系
验证SFFD作为ceRNA海绵吸附miR-202-3p，并调控COX1表达。
RNA pull-down、双荧光素酶报告基因实验验证SFFD与miR-202-3p的结合，以及miR-202-3p对COX1 3'UTR的靶向调控。
体外功能验证SFFD/miR-202-3p/COX1轴
验证SFFD通过miR-202-3p/COX1轴调控颗粒细胞增殖、凋亡和E2分泌。
过表达或敲低SFFD，同时使用miR-202-3p mimic或inhibitor，检测颗粒细胞增殖、凋亡、E2分泌及相关基因表达。
体内验证SFFD对小鼠性成熟的影响
验证SFFD在体内对卵泡发育和性成熟的作用。
向3周龄雌性小鼠卵巢注射LV-lnc SFFD或sh-lnc SFFD慢病毒，每周1次，持续3周，观察性成熟年龄、E2水平、卵巢组织学和颗粒细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 曲古抑菌素A | MedChemExpress | HY-15144 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | -- |
| 细胞处理 | 生长分化因子9 | MCE | -- |
| 骨形态发生蛋白15 | MCE | -- | |
| RT-qPCR | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo | -- |
| SYBR Green qRT-PCR预混液 | -- | -- | |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| EdU增殖检测 | Cell-Light EdU试剂盒 | RiboBio | -- |
| 流式凋亡检测 | Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 凋亡检测 | Caspase 3/7活性检测试剂盒 | Elabscience | -- |
| ELISA | 小鼠E2 ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | ml063198 |
| 小鼠P4 ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | ml001945 | |
| 小鼠雄激素ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | ml037278 | |
| 猪E2 ELISA试剂盒 | Enzyme-linked Biotechnology | ml002366 | |
| 动物实验 | 慢病毒载体（LV-lnc SFFD和sh-lnc SFFD） | Dongze Biotech | -- |
| 凋亡检测 | TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime Biotech | -- |
| 染色质免疫沉淀 | Pierce ChIP试剂盒 | Thermo | -- |
| H3K27ac抗体 | Active Motif | -- | |
| IgG抗体 | Millipore | 12-370 | |
| 荧光原位杂交 | lncRNA FISH探针混合物 | RiboBio | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | pmirGLO报告载体 | Promega | -- |
| 荧光素酶检测试剂盒 | Promega | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| HDAC1抗体 | abcam | ab109411 | |
| HDAC2抗体 | abcam | ab32117 | |
| HDAC3抗体 | abcam | ab32369 | |
| PCNA抗体 | proteintech | 10205-2-AP | |
| CCND1抗体 | proteintech | 26939-1-AP | |
| CASP3抗体 | proteintech | 19677-1-AP | |
| HSD17B1抗体 | proteintech | 25334-1-AP | |
| Tubulin抗体 | proteintech | 11224-1-AP | |
| RACE | 5'/3'-RACE试剂盒（第二代） | Roche | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠TSA处理 | TSA剂量0.5 mg/kg，每周3次，持续3周；小鼠周龄和性别；分组及样本量 阅读提示：见Materials and Methods第2.1节 |
| 猪颗粒细胞培养与处理 | 卵泡大小（3-5mm）；培养基（DMEM+10%FBS）；培养条件（37℃，5% CO2）；TSA浓度0.1 μM处理24小时；GDF9和BMP15浓度及处理时间 阅读提示：见Materials and Methods第2.2节 |
| HDAC1敲低 | siRNA序列（HDAC1-siRNA2）及转染条件 阅读提示：见Results第3.2节及Supplementary Tables |
| SFFD敲低和过表达 | si-lnc SFFD-2序列；pcDNA3.1-lnc SFFD构建；转染浓度和时间 阅读提示：见Materials and Methods第2.2节及Supplementary Tables |
| 慢病毒注射 | 慢病毒滴度（1×10^7 TU）、注射频率（每周1次，共3周）、小鼠周龄和品系 阅读提示：见Materials and Methods第2.7节 |
| miR-202-3p mimic/inhibitor处理 | mimic/inhibitor序列及转染浓度 阅读提示：见Materials and Methods第2.2节及Supplementary Tables |
| 双荧光素酶报告基因 | 报告质粒构建（SFFD-WT/MUT, COX1 3'UTR-WT/MUT）；共转染比例和时间 阅读提示：见Materials and Methods第2.9节 |
| ChIP实验 | 抗体（H3K27ac, IgG）；引物序列（Table 3） 阅读提示：见Materials and Methods第2.8节 |