验证HMGB1对巨噬细胞胞葬作用的影响
确定细胞外HMGB1是否抑制巨噬细胞介导的凋亡细胞清除
用BALF或rHMGB1处理BMDMs，与CFSE标记的凋亡胸腺细胞共培养，通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测胞葬作用。
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细胞外HMGB1通过抑制Rab43调控的CD91细胞表面运输损害巨噬细胞介导的胞葬作用
Extracellular HMGB1 Impairs Macrophage-Mediated Efferocytosis by Suppressing the Rab43-Controlled Cell Surface Transport of CD91.
实验完整度
高包含体外细胞实验（BMDMs胞葬作用、Rab43敲除、CD91运输）、体内动物模型（LPS诱导ALI小鼠模型、Rab43-cKO小鼠）及分子机制验证（免疫共沉淀、共定位）。
主要模型
骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） RAW264.7细胞 LPS诱导ALI小鼠模型 髓系特异性Rab43敲除（Rab43-cKO）小鼠
重点核对
rHMGB1处理浓度：2 μg/ml，处理时间：12小时 BMDMs与凋亡胸腺细胞共培养比例：1:10，共培养时间：2小时 LPS诱导ALI剂量：5 mg/kg（气管内注射） Rab43-cKO小鼠（Rab43floxp/floxp/LysMCre+/+）与对照Rab43-C小鼠（Rab43floxp/floxp/LysMCre−/−） CD91阻断抗体处理时间：1小时
摘要
高迁移率族蛋白B1（HMGB1）可通过抑制巨噬细胞介导的凋亡细胞清除来损害吞噬细胞功能，从而延迟肺部炎症消退，并促进急性肺损伤（ALI）和急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的进展。然而，HMGB1介导的胞葬作用抑制的精确机制仍不清楚。本研究旨在确定HMGB1对巨噬细胞介导的胞葬作用的影响。我们发现HMGB1阻止了骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的胞葬作用，并抑制了Ras相关GTP结合蛋白43（Rab43）的表达，Rab43是Ras相关结合（Rab）家族的成员。Rab43表达下调导致BMDMs对凋亡胸腺细胞清除受损。对HMGB1处理和Rab43缺陷的BMDMs的后续分析显示，CD91（一种吞噬细胞识别受体）从细胞质到细胞表面的运输受到抑制。值得注意的是，Rab43直接与CD91相互作用以介导其细胞内运输。此外，Rab43敲除延迟了ALI小鼠的炎症消退并加重了肺组织损伤。因此，我们的结果证明HMGB1通过抑制Rab43调控的CD91顺行运输来损害巨噬细胞介导的胞葬作用并延迟炎症消退，提示恢复Rab43水平是减轻人类ALI和ARDS的有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞外HMGB1如何抑制巨噬细胞介导的胞葬作用，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- HMGB1抑制Rab43表达，导致Rab43调控的CD91从内质网到细胞表面的顺行运输受阻，从而减少细胞表面CD91水平，损害巨噬细胞对凋亡细胞的清除，延迟炎症消退。
- 主要证据
- 体外实验显示rHMGB1处理降低BMDMs中Rab43表达并减少胞葬作用；Rab43敲除降低CD91细胞表面水平；免疫共沉淀显示Rab43与CD91直接相互作用；体内实验显示Rab43敲除加重LPS诱导的ALI小鼠肺损伤并延迟炎症消退。
- 研究意义
- 恢复巨噬细胞中Rab43水平以增强胞葬作用可能是治疗ALI和ARDS的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测HMGB1对Rab43表达的影响
探究HMGB1是否改变Rab43的表达水平
Western blot和qPCR检测rHMGB1或BALF处理后BMDMs中Rab43蛋白和mRNA水平；免疫荧光观察Rab43胞内分布。
评估Rab43缺陷对胞葬作用的影响
确定Rab43缺失是否损害巨噬细胞胞葬作用
比较Rab43-cKO和Rab43-C BMDMs体外吞噬凋亡胸腺细胞的能力；在LPS诱导的ALI小鼠模型中分析体内胞葬作用和中性粒细胞比例。
分析HMGB1对CD91细胞表面定位的影响
探究HMGB1是否通过影响CD91的运输来抑制胞葬作用
流式检测rHMGB1处理后BMDMs细胞表面CD91水平；共聚焦显微镜观察CD91亚细胞定位及其与内质网和高尔基体标志物的共定位。
验证Rab43敲除对CD91运输的影响
确定Rab43是否调控CD91从内质网到细胞表面的运输
流式和Western blot检测Rab43-cKO BMDMs中细胞表面和细胞质CD91水平；共聚焦观察CD91分布和与内质网、高尔基体的共定位。
验证Rab43与CD91的相互作用
确定Rab43是否直接与CD91结合以介导其运输
在RAW264.7细胞中过表达FLAG-Rab43或GFP-Rab43，通过免疫共沉淀检测Rab43与CD91的相互作用；共聚焦观察GFP-Rab43与CD91或内质网标志物的共定位。
评估Rab43敲除对LPS诱导ALI的影响
确定Rab43缺失是否加重体内炎症和肺损伤
对Rab43-C和Rab43-cKO小鼠气管内注射LPS，检测肺组织病理学、肺水肿程度（W/D比值）、BALF蛋白浓度、炎症因子（TNF-α、IL-6）水平和凋亡中性粒细胞数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞培养和处理
蛋白相互作用分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 巨噬细胞培养基，MAM | ScienCell | 1921 |
| 重组巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） | Bioworld Technology | BK0128 | |
| Gibco® 细胞解离缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 13150016 | |
| 药物处理 | 大肠杆菌055:B5脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | L2880 |
| 重组HMGB1（rHMGB1） | Sino Biological | 50913-M01H | |
| 地塞米松 | MCE | HY-14648 | |
| 流式分析 | PE膜联蛋白V凋亡检测试剂盒I | BD Biosciences | 559763 |
| 蛋白质检测 | Pierce™ BCA蛋白检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| M-PER™ 蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78510 | |
| cOmplete™ 无EDTA蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 04693159001 | |
| PageRuler™ 预染蛋白分子量标准 | Thermo Fisher Scientific | 26616 | |
| Immobilon 蛋白质印迹化学发光HRP底物 | Millipore | WBKLS0500 | |
| 膜蛋白提取 | Mem-PER™ Plus膜蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89842 |
| RNA提取和qPCR | TRIzol™ 试剂 | Sigma-Aldrich | T9424 |
| GoScript™ 逆转录系统 | Promega | A2800 | |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6001 | |
| 免疫荧光 | 免疫荧光应用解决方案试剂盒 | CST | 12727 |
| 含DAPI的抗淬灭封片剂 | Coolaber | SL | |
| Cytofix/Cytoperm™ 固定/透化试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| 高尔基体染色 | 高尔基体染色试剂盒—绿色荧光 | Cytopainter | Abcam | ab139483 |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2003 |
| 细胞标记 | CFDA SE细胞增殖检测与追踪试剂盒 | Beyotime Biotechnology | C0051 |
| 细胞膜染色 | Dil染料 | Thermo Fisher Scientific | D3911 |
| ELISA | 高迁移率族蛋白1 ELISA试剂盒 | Cloud-Clone Corp. | SEA399Mu |
| 转染 | FuGENE® HD转染试剂 | Promega | 2311 |
| 细胞分选 | 抗F4/80超纯微珠，小鼠 | Miltenyi Biotec | 130-110-443 |
| MS柱 | Miltenyi Biotec | 5190110006 | |
| Western blot分析 | 抗RAB43抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515460 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | CST | 4970S | |
| 抗CD91抗体 | Abcam | ab92544 | |
| Calnexin抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA3-027 | |
| 抗FLAG抗体 | CST | 14793 | |
| 抗GFP抗体 | CST | 2956 | |
| 小鼠抗兔IgG（构象特异性）（L27A9）单克隆抗体（HRP偶联） | CST | 5127 | |
| ATP1A1多克隆抗体 | Proteintech | 14418-1-AP | |
| 流式分析 | PE抗小鼠CD91抗体 | Bioss | bs-10920R-PE |
| APC抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123116 | |
| FITC抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123108 | |
| APC/Cyanine7抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123118 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠Ly-6G/Ly-6C（Gr-1）抗体 | BioLegend | 108416 | |
| 抗CD16/32抗体 | BioLegend | 101302 | |
| PerCP标记的抗小鼠/人CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081F | |
| APC抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117310 | |
| BV421抗小鼠MerTK抗体 | BD Biosciences | 747837 | |
| PE抗小鼠CD36抗体 | BioLegend | 102605 | |
| 中和实验 | 抗HMGB1中和抗体 | Arigo | ARG66714 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor® 488偶联的AffiniPure山羊抗小鼠IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-003 |
| Alexa Fluor® 594偶联的AffiniPure山羊抗兔IgG | Jackson Immunoresearch | 111-585-003 | |
| 免疫共沉淀 | pcDNA3.1-3xflag-Rab43质粒 | Sangon Biotech | -- |
| pcDNA3.1-GFP-Rab43质粒 | Sangon Biotech | -- | |
| 仪器 | FACSCanto™ II临床流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 徕卡共聚焦显微镜 | Leica Microsystems | -- | |
| 细胞培养耗材 | 培养皿 | NEST Biotechnology | 801002 |
| BALF收集 | 聚偏二氟乙烯膜 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和处理 | BMDMs分离自6-8周龄Rab43-C或Rab43-cKO小鼠；培养于含10%胎牛血清和100 ng/ml M-CSF的MAM培养基中；rHMGB1处理浓度和持续时间。 阅读提示：Materials and Methods中的Isolation and Culture of Macrophages |
| 胞葬作用分析 | 凋亡胸腺细胞用1 mM地塞米松处理6小时；BMDMs与凋亡细胞比例和共培养时间。 阅读提示：Materials and Methods中的In Vitro Phagocytosis Assay |
| CD91表面表达检测 | 流式抗体浓度和孵育条件；BALF中巨噬细胞的门控策略（F4/80+CD11b+CD11c−）。 阅读提示：Materials and Methods中的Flow Cytometry Analysis of Cell Surface CD91 |
| 体内ALI模型 | LPS剂量（5 mg/kg）和给药方式（气管内注射）；小鼠品系和年龄；处理时间点。 阅读提示：Materials and Methods中的Animals and ALI/ARDS Model Construction |
| 组织病理分析 | 肺组织固定、包埋和H&E染色步骤；肺损伤评分标准。 阅读提示：Materials and Methods中的Lung Histological Analysis and Lung Injury Scoring |