体外细胞毒性评估
确定ESPS对HepG2.2.15和Huh7细胞的毒性，以确定安全浓度范围。
使用CCK8法检测不同浓度ESPS（50、100、200、400、800 μg/ml）处理48小时后细胞的存活率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
来自于土鳖虫（Eupolyphaga sinensis Walker）的多糖具有体外和体内抗乙型肝炎病毒活性
A Polysaccharide From Eupolyphaga sinensis Walker With Anti-HBV Activities In Vitro and In Vivo.
实验完整度
高包含体外细胞实验（HepG2.2.15）和体内小鼠模型（HBV转基因小鼠），并进行了功能验证和机制研究（TLR4通路、干扰素信号通路、NF-κB/ERK/HNF4α轴）
主要模型
HepG2.2.15细胞 C57BL/6J HBV转基因小鼠模型
重点核对
ESPS处理浓度：50、100、200、400 μg/ml ESPS体内给药剂量：20和40 mg/kg/2天，静脉注射，连续20天 阳性对照拉米夫定（3TC）剂量及给药方式：30 mg/kg/2天，灌胃 TLR4抑制剂TAK242使用 HBV DNA、RNA及蛋白检测时间点（第6天、第9天）
摘要
乙型肝炎病毒（HBV）感染仍然是全球人类健康的主要威胁。近年来，具有抗病毒活性和低毒性的中药备受关注。在我们先前的研究中，已从土鳖虫中分离并表征了一种多糖（ESPS），但其抗HBV作用仍不清楚。在体外和体内研究了ESPS的抗HBV活性及其调控途径。结果表明，ESPS以剂量依赖的方式显著抑制HepG2.2.15细胞上清液中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的产生；ESPS也降低了HBV RNA和核心蛋白的表达。使用HBV转基因小鼠的体内研究进一步表明，ESPS（20和40 mg/kg/2天）显著降低了血清中HBsAg、HBeAg和HBV DNA的水平，以及小鼠肝脏中的HBV DNA和HBV RNA。此外，ESPS激活了Toll样受体4（TLR4）通路；观察到血清中IFN-β、TNF-α和IL-6水平升高，表明ESPS的抗HBV作用是通过增强先天免疫功能实现的。总之，我们的研究表明ESPS是一种潜在抗HBV成分，在开发新型抗HBV药物方面具有重要价值。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在探究土鳖虫多糖ESPS是否具有抗HBV活性及其潜在的作用机制。
- 核心机制
- ESPS通过激活TLR4信号通路，增强干扰素信号通路和炎症因子（IFN-β、TNF-α、IL-6）的表达，进而激活NF-κB/ERK通路，下调HNF4α表达，抑制HBV核心启动子活性，从而抑制HBV复制。
- 主要证据
- 体外实验显示ESPS呈剂量依赖性抑制HepG2.2.15细胞中HBsAg、HBeAg、HBV DNA、HBV RNA及核心蛋白的表达，并激活TLR4通路；体内实验显示ESPS降低HBV转基因小鼠血清和肝脏中的HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平，并上调TLR4、干扰素相关基因表达。
- 研究意义
- 研究表明ESPS是一种潜在抗HBV成分，为开发新型抗HBV药物提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗HBV活性检测
评估ESPS对HBV复制和抗原分泌的抑制作用。
HepG2.2.15细胞用ESPS（50-400 μg/ml）处理6或9天，检测HBsAg、HBeAg、胞外及胞内HBV DNA、HBV pgRNA、总RNA以及HBV蛋白表达。
TLR4通路验证
验证ESPS是否通过TLR4发挥抗HBV作用。
检测ESPS处理后TLR2、TLR4 mRNA和蛋白表达变化；使用TLR4抑制剂TAK242阻断TLR4，检测ESPS对HBV pgRNA、总mRNA和分泌HBV DNA的抑制作用。
干扰素信号通路检测
探究ESPS是否激活干扰素信号通路。
检测ESPS处理后IRF3磷酸化水平、IFN-α、IFN-β、OAS和MxA的mRNA水平，以及IFN-β分泌水平；使用LPS作为阳性对照。
NF-κB和ERK通路及HNF4α检测
探究ESPS是否通过NF-κB/ERK/HNF4α轴抑制HBV转录。
检测ESPS处理后NF-κB和ERK1/2磷酸化水平，以及IL-6、TNF-α和HNF4α的表达水平；并检测HBV核心启动子活性。
体内抗HBV活性评估
评估ESPS在HBV转基因小鼠体内的抗HBV效果。
通过高压水动力法注射pAAV-1.2HBV质粒建立HBV小鼠模型，分组后给予ESPS（20和40 mg/kg/2天）或3TC（30 mg/kg/2天）治疗20天，检测血清和肝脏中HBV标志物。
体内免疫调节活性检测
验证ESPS在体内是否通过TLR4通路增强先天免疫。
检测ESPS治疗后小鼠肝脏TLR4、IL-6、TNF-α、OAS、MxA、HNF4α的mRNA表达以及血清IFN-β水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 链霉素 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 细胞毒性检测 | CCK8试剂盒 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | 南京诺唯赞生物科技有限公司 | -- |
| ELISA检测 | IFN-β ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| HBsAg ELISA试剂盒 | 上海科华生物工程股份有限公司 | -- | |
| HBeAg ELISA试剂盒 | 上海科华生物工程股份有限公司 | -- | |
| DNA提取 | Qiaamp DNA血液迷你试剂盒 | Qiagen | -- |
| RT-qPCR | PrimeScript RT试剂盒 | Takara | -- |
| TB预混Ex Taq | Takara | -- | |
| qPCR | CFX96实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Bestbio | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | TIANGEN | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Action-award | -- | |
| 抗TLR4抗体 | GeneTex | GTX75742 | |
| 抗TLR2抗体 | GeneTex | GTX00996 | |
| 抗磷酸化P65抗体 | GeneTex | GTX133899 | |
| 抗P65抗体 | GeneTex | GTX102090 | |
| 抗IRF3抗体 | GeneTex | GTX84287 | |
| 抗磷酸化IRF3抗体 | GeneTex | GTX130422 | |
| 抗HBc抗体 | Santa Cruz | SC-23945 | |
| 抗HBs抗体 | Santa Cruz | SC-53299 | |
| 抗HB pol抗体 | Santa Cruz | SC-81590 | |
| 抗HNF4α抗体 | GeneTex | GTX01036 | |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz | SC-47778 | |
| 二抗 | ABclonal | -- | |
| DAB免疫组织化学显色试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 药物处理 | 脂多糖 | Sigma | -- |
| 拉米夫定 | Sigma | -- | |
| TAK242 | MCE | -- | |
| 动物实验 | pAAV-1.2HBV质粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HepG2.2.15细胞的培养条件：DMEM+10% FBS+100 U/ml青霉素+100 μg/ml链霉素，37°C，5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Cells and Animals |
| 体外给药 | ESPS处理浓度（50, 100, 200, 400 μg/ml）及处理时间（6天和9天）；阳性对照3TC浓度（2.45 μg/ml）；TLR4抑制剂TAK242的使用 阅读提示：Methods (Cell Cytotoxicity and Viability Assays, q-PCR, Western Blot) 和 Figure legends (Figure 1, 2, 3, 4) |
| 体内模型建立 | C57BL/6J小鼠，尾静脉高压注射8 μg pAAV-1.2HBV质粒，注射时间5-8秒 阅读提示：Materials and Methods, Cells and Animals |
| 体内给药与分组 | 分组：PBS组、低剂量ESPS（20 mg/kg/2天）、高剂量ESPS（40 mg/kg/2天）、3TC（30 mg/kg/2天）；给药途径：ESPS静脉注射，3TC灌胃；给药体积10 ml/kg；连续20天 阅读提示：Materials and Methods, Cells and Animals 和 Figure legend (Figure 5) |
| 检测指标 | 血清HBsAg、HBeAg、HBV DNA和IFN-β水平；肝组织HBV DNA、pgRNA、总RNA及TLR4、IL-6、TNF-α、OAS、MxA、HNF4α mRNA表达；HBcAg免疫组化 阅读提示：Methods (Detection of HBsAg, HBeAg and IFN-β; Immunohistochemical; q-PCR) 和 Figure legends (Figure 5, 6) |