临床样本中TAMs的染色质可及性分析
鉴定TAMs中与单核细胞相比差异开放的染色质区域，并预测关键转录因子。
从PDAC组织分离CD206+ TAMs和外周血CD14+单核细胞，进行ATAC-seq分析；用HOMER进行基序分析。
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CTCF/LncRNA-PACERR复合物招募E1A结合蛋白p300，通过直接调控PTGS2表达诱导胰腺导管腺癌中的促肿瘤巨噬细胞
The CTCF/LncRNA-PACERR complex recruits E1A binding protein p300 to induce pro-tumour macrophages in pancreatic ductal adenocarcinoma via directly regulating PTGS2 expression.
实验完整度
高包含患者样本分离TAMs的ATAC-seq、THP1来源TAMs的体外功能实验、小鼠肝转移模型、ChIP-seq/ChIRP-seq等多组学分析及RIP/RNA pull-down等机制验证，实验层级丰富。
主要模型
人PDAC组织分离的CD206+ TAMs THP1细胞诱导分化的TAM模型 BALB/c裸鼠和C57BL/6小鼠肝转移模型 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）
重点核对
CTCF和PACERR的敲低是否成功（通过qPCR和Western blot验证） THP1细胞PMA分化及与PANC-1/PATU-8988共培养条件 M2标志物（CD206、CD163等）和M1标志物的表达变化 Transwell实验中Matrigel浓度、细胞数和培养时间 小鼠模型中PANC-1或PAN02细胞与巨噬细胞共注射的细胞比例和数量
摘要
背景：肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）在促进胰腺导管腺癌（PDAC）进展中发挥重要作用。本研究旨在探讨PDAC肿瘤微环境中调控促肿瘤M2极化TAMs的表观遗传机制。方法：本研究基于PDAC组织中分离的离体TAMs和体外THP1来源的TAM模型。采用RNA测序（RNA-seq）、转座酶可及染色质测序和染色质免疫沉淀测序研究基因表达、染色质可及性、转录因子结合位点和组蛋白修饰。用慢病毒在THP1来源的TAMs中进行基因敲低，并通过体外和体内功能实验研究THP1来源的TAMs对PDAC细胞侵袭和转移能力的影响。通过染色质分离RNA纯化测序分析RNA-染色质相互作用。通过RNA免疫沉淀和RNA pull-down研究RNA-蛋白相互作用。结果：我们的数据显示，与单核细胞相比，转录因子CTCF在TAMs中高表达，并预测显著富集于超可及染色质区域。CTCF+ TAMs的高浸润与PDAC患者的不良预后显著相关。在THP1来源的TAMs中敲低CTCF导致M2极化TAMs的特异性标志物（包括CD206和CD163）下调。CTCF敲低的THP1来源TAMs显示出降低的侵袭和转移能力。进一步的多组学数据整合分析揭示，前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）和PTGS2反义NF-κB1复合物介导的表达调控RNA（PACERR）是CTCF的关键下游靶标，且彼此正相关，它们在染色体上紧密相邻。敲低PACERR表现出与CTCF敲低的THP1来源TAMs相似的表型。此外，PACERR可直接结合CTCF，并招募组蛋白乙酰转移酶E1A结合蛋白p300至PACERR和PTGS2的启动子区域，从而增强组蛋白乙酰化和基因转录，促进PDAC中TAMs的M2极化。结论：我们的研究揭示了PDAC肿瘤微环境中促进促肿瘤M2极化TAMs的新型表观遗传调控机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PDAC肿瘤微环境中TAMs向促肿瘤M2极化的表观遗传调控机制是什么？
- 核心机制
- CTCF在TAMs中高表达，转录激活LncRNA-PACERR，PACERR与CTCF直接结合形成复合物，招募组蛋白乙酰转移酶EP300至PTGS2启动子区域，增强组蛋白乙酰化（H3K27ac和H3K9ac），增加染色质可及性，从而上调PTGS2表达，促进M2极化和促肿瘤功能。
- 主要证据
- 通过ATAC-seq发现CTCF基序富集；CTCF或PACERR敲低导致M2标志物下调并抑制肿瘤细胞侵袭迁移；ChIP-seq和ChIRP-seq显示CTCF和PACERR结合PTGS2启动子；RIP和RNA pull-down证明CTCF-PACERR互作；Co-IP证明CTCF-EP300复合物形成；ChIP-qPCR显示EP300招募依赖CTCF/PACERR；小鼠肝转移模型验证功能。
- 研究意义
- 该研究揭示了TAMs中PTGS2表达的新型表观遗传调控机制，为设计干扰TAMs促肿瘤功能的治疗策略提供了依据，特别是通过靶向LncRNA-PACERR或CTCF/PACERR复合物来调控PTGS2表达，可能避免现有COX-2抑制剂的脱靶副作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
CTCF表达与临床预后关联分析
评估CTCF+ TAMs浸润水平与PDAC患者预后的关系。
对110例PDAC患者的组织芯片进行CD68、CD206和CTCF免疫组化染色，根据CTCF+ TAMs比例分组，进行Kaplan-Meier生存分析。
CTCF敲低对TAMs M2极化和促肿瘤功能的影响
验证CTCF在调控TAMs M2极化和促肿瘤功能中的作用。
用慢病毒敲低THP-1细胞中的CTCF，经PMA诱导分化为巨噬细胞并与PDAC细胞共培养，检测M2标志物表达、细胞因子分泌、肿瘤细胞侵袭迁移能力；在体内小鼠模型中验证。
多组学整合分析鉴定CTCF下游靶基因
揭示CTCF调控的基因表达和表观遗传变化，并寻找关键下游靶标。
对CTCF敲低或对照的THP-1来源TAMs进行RNA-seq、ChIP-seq（CTCF、H3K27ac、H3K9ac、H3K27me3）和ATAC-seq，整合分析差异表达基因和表观修饰变化，最终聚焦PTGS2和PACERR。
验证CTCF对PTGS2和PACERR表达的调控
验证CTCF直接结合PTGS2启动子并调控其表达，同时影响PACERR表达。
通过ChIP-qPCR检测CTCF结合；qPCR和Western blot检测敲低CTCF后PTGS2和PACERR的表达；分析染色质修饰状态。
PACERR对PTGS2的顺式调控作用
探究PACERR是否作为核内LncRNA结合PTGS2启动子并正调控其表达。
通过细胞分级和FISH检测PACERR定位；ChIRP-seq分析PACERR全基因组结合位点；敲低PACERR后检测PTGS2表达和启动子结合变化；双荧光素酶报告实验验证相互作用。
PACERR敲低对TAMs表型和功能的影响
验证PACERR在TAMs M2极化和促肿瘤功能中的必要性。
敲低PACERR后检测M2标志物、细胞因子、肿瘤细胞侵袭迁移能力；在PACERR敲低的基础上过表达PTGS2或CTCF，观察表型是否恢复。
CTCF-PACERR相互作用及EP300招募机制
阐明CTCF和PACERR是否形成复合物并招募EP300至PTGS2启动子，以及EP300对组蛋白乙酰化和基因转录的作用。
通过RIP验证CTCF结合PACERR；RNA pull-down验证PACERR结合CTCF；Co-IP检测CTCF-EP300复合物；ChIP-qPCR检测EP300和H3K27ac在PTGS2启动子的富集；敲低EP300后检测PTGS2表达。
临床样本中CTCF、PACERR和EP300共定位及预后分析
验证CTCF、PACERR和EP300在临床TAMs中的共定位以及作为预后标志物的价值。
对PDAC组织芯片进行四色IF和FISH染色，分析共定位；基于TCGA数据和110例PDAC患者生存数据，分析多基因signature与预后的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | CD206-PE抗体 | BD Pharmingen | 555954 |
| CD11b-PE抗体 | BD Pharmingen | 557321 | |
| 细胞分选 | CD14微磁珠 | Miltenyi | 130-050-201 |
| 细胞培养 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | -- | -- |
| 细胞转染 | 脂质体转染试剂2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | Gene-Chem | -- |
| 稳定细胞系筛选 | 嘌呤霉素 | Sangon Biotech | -- |
| Transwell实验 | 基质胶 | BD | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 免疫组化 | CTCF抗体 | CST | 3418 |
| CD206抗体 | CST | 24595 | |
| CD68抗体 | CST | 76437 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PARIS试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| RT-qPCR | HiScript III-RT SuperMix | Vazyme Biotech | -- |
| AceQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech | -- | |
| qPCR | GAPDH引物 | -- | -- |
| β-肌动蛋白引物 | -- | -- | |
| U6引物 | -- | -- | |
| Western blot | 蛋白质印迹/免疫沉淀裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| CTCF抗体 | Abcam | ab26271 | |
| COX2抗体 | Abcam | ab16895 | |
| GAPDH抗体 | CST | 3936 | |
| β-微管蛋白抗体 | CST | 2128 | |
| EP300抗体 | Abcam | ab275378 | |
| ELISA | 人IL-10 ELISA试剂盒 | -- | -- |
| 人TGF-β ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| 人精氨酸酶-1 ELISA试剂盒 | -- | -- | |
| 荧光素酶报告实验 | 细胞裂解液 | Vazyme Biotech | -- |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 流式细胞术 | Fc受体阻断剂 | Biolegend | 422302 |
| CD163-PE抗体 | Biolegend | 333605 | |
| CD206-APC抗体 | Biolegend | 321109 | |
| RNA-seq | RNeasy小型试剂盒 | QIAGEN | -- |
| ATAC-seq | Tn5转座体 | Vazyme Biotech | -- |
| ChIP | H3K27ac抗体 | Abcam | ab4729 |
| H3K27me3抗体 | CST | 9733S | |
| CTCF抗体 | Millipore | 07-729 | |
| H3K9ac抗体 | CST | 9649 | |
| H3K4me抗体 | CST | 5326 | |
| ChIP-seq | VAHTS通用DNA文库制备试剂盒(Illumina V3) | Vazyme Biotech | -- |
| RIP | MagnaRIP RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | -- |
| IgG抗体 | Elabscience | E-AB-1034 | |
| FLAG抗体 | CST | 14793 | |
| Co-IP | 蛋白酶抑制剂 | NCM Biotech | -- |
| 蛋白A磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 荧光显微镜 | SP-8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| RNA-FISH | PACERR寡核苷酸探针 | Servicebio Technology | -- |
| 荧光显微镜 | Zeiss | -- | |
| Western blot | Tanon-5200化学发光成像系统 | Tanon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TAMs分离 | CD206阳性选择、CD14阳性选择、组织采集时间（10分钟内） 阅读提示：Methods 2.1 Clinical samples |
| 细胞培养和分化 | THP-1培养条件（RPMI-1640, 10% FBS）、PMA浓度（100 ng/ml）和处理时间（48小时）、共培养细胞系（PANC-1, PATU-8988） 阅读提示：Methods 2.2 Cell culture and reagents |
| 基因敲低 | 慢病毒载体（LV3-pGLV-GFP-puromycin）、MOI（100）、polybrene浓度（5 μg/ml）、嘌呤霉素筛选浓度（5 μg/ml） 阅读提示：Methods 2.4 Plasmids and stable cell lines, 2.5 Lentivirus production and transduction |
| Transwell侵袭和迁移实验 | 细胞数（5×10^5 PANC-1, 3×10^5 THP-1）、Matrigel浓度（1.25 mg/ml）、培养时间（1天或2天） 阅读提示：Methods 2.7 Transwell invasion and migration assay |
| 小鼠肝转移模型 | 小鼠品系和年龄（BALB/c nude, C57BL/6, 6周龄）、注射细胞数和比例（1×10^7 PANC-1 + 5×10^6 THP-1；1×10^7 PAN02 + 5×10^6 BMDM）、脾内注射 阅读提示：Methods 2.11 Tumour xenograft assay |
| ChIP-qPCR | 抗体（CTCF, H3K27ac, H3K27me3, H3K9ac, EP300）、PCR扩增循环数（45循环） 阅读提示：Methods 2.20 Chromatin immunoprecipitation |