验证JMJD6对IFN-I产生的抑制作用
确定JMJD6是否影响病毒或poly(I:C)诱导的IFN-I产生。
在HEK293T细胞中过表达JMJD6，检测IFN-β启动子、ISRE启动子活性以及内源性IFN-β和ISG mRNA水平。
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JMJD6通过招募RNF5促进活化IRF3的K48泛素化，负调控胞质RNA诱导的抗病毒信号
JMJD6 negatively regulates cytosolic RNA induced antiviral signaling by recruiting RNF5 to promote activated IRF3 K48 ubiquitination.
实验完整度
高包含细胞系敲低/敲除、过表达、体内小鼠模型、蛋白质组学、免疫共沉淀、泛素化分析等多层级功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 HeLa细胞 JMJD6敲除小鼠（piggyBac转基因） VSV感染模型
重点核对
JMJD6敲低/敲除对IFN-β产生的影响 JMJD6与IRF3的相互作用及其磷酸化依赖性 JMJD6对IRF3蛋白稳定性及泛素化的影响 RNF5在JMJD6介导的IRF3降解中的作用 小鼠体内JMJD6敲低对VSV感染抵抗力的影响
摘要
抗病毒免疫应答的负调控对于宿主维持稳态至关重要。含Jumonji结构域的蛋白6（JMJD6）此前被鉴定在RNA病毒感染中具有多种功能。在病毒RNA识别后，视黄酸诱导基因I样受体（RLRs）与线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）物理相互作用，并激活TANK结合激酶1（TBK1）以诱导I型干扰素（IFN-I）的产生。本文证明JMJD6降低响应胞质poly(I:C)和RNA病毒感染（包括仙台病毒（SeV）和水疱性口炎病毒（VSV））的I型干扰素（IFN-I）产生。JMJD6的遗传失活增强IFN-I产生并损害病毒复制。我们的无偏蛋白质组学筛选表明JMJD6以依赖RNF5的方式促进IRF3的K48泛素化降解。通过piggyBac转座子介导的基因转移删除JMJD6基因的小鼠显示出增强的VSV触发的IFN-I产生和对病毒易感性的降低。这些发现将JMJD6归类为宿主对胞质病毒RNA先天免疫应答的负调控因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- JMJD6如何调控RNA病毒诱导的IFN-I产生及其分子机制？
- 核心机制
- JMJD6通过其中间结构域（氨基酸173-288）与活化的IRF3结合，并招募E3泛素连接酶RNF5，促进IRF3的K48连接多聚泛素化，进而通过蛋白酶体途径降解活化的IRF3，负调控先天免疫信号。
- 主要证据
- 过表达JMJD6抑制IFN-I产生；敲低/敲除JMJD6增强IFN-I产生；免疫共沉淀证明JMJD6与磷酸化IRF3相互作用；RNF5敲除及突变体实验证实RNF5参与IRF3泛素化降解；小鼠实验显示JMJD6敲低增强VSV抵抗。
- 研究意义
- 揭示了JMJD6作为宿主先天免疫应答负调控因子的新功能，为理解RNA病毒感染时免疫稳态的维持提供了机制，并可能部分解释癌细胞对病毒感染的易感性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证JMJD6缺失对IFN-I产生的影响
确定内源性JMJD6是否抑制IFN-I产生。
使用siRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除JMJD6，检测SeV或VSV感染后IFN-β和ISG表达、病毒复制。
鉴定JMJD6作用的信号节点
确定JMJD6抑制IFN-I产生的信号通路中靶向的分子。
在HEK293T细胞中过表达RIG-I、MDA5、MAVS、TBK1、IRF3或IRF7，检测JMJD6对IFN-β启动子激活的影响。
验证JMJD6对IRF3蛋白水平和磷酸化的影响
确定JMJD6是否通过影响IRF3表达来抑制信号。
在JMJD6敲除细胞中检测SeV感染后IRF3总蛋白和磷酸化水平。
验证JMJD6与IRF3的相互作用及其依赖性
确定JMJD6是否与活化的IRF3特异性结合。
通过免疫共沉淀检测JMJD6与IRF3野生型、IRF3-5D、IRF3-5A突变体及内源性IRF3在病毒感染或poly(I:C)刺激下的相互作用，并用λ磷酸酶处理验证磷酸化依赖性。
验证JMJD6促进IRF3降解及其机制
确定JMJD6是否通过蛋白酶体途径促进活化IRF3降解。
在过表达JMJD6的细胞中检测IRF3半衰期，使用MG132、CQ、Z-VAD-FMK处理确定降解途径，检测IRF3泛素化水平。
鉴定JMJD6招募的E3泛素连接酶
确定JMJD6促进IRF3 K48泛素化所依赖的E3连接酶。
通过亲和纯化-质谱鉴定JMJD6相互作用蛋白，验证RNF5与JMJD6的结合，检测RNF5对IRF3泛素化的影响，并通过RNF5敲除和回补实验验证其必要性。
验证体内JMJD6缺失对VSV感染的影响
确定JMJD6在体内抗病毒免疫中的作用。
利用piggyBac转座子系统在C57BL/6J小鼠肝脏中敲低JMJD6，尾静脉注射VSV，检测IFN-β、ISG表达及病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | MG132 | Merck | -- |
| 磷酸氯喹 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Z-VAD-FMK | Sigma-Aldrich | -- | |
| 刺激处理 | 聚肌胞苷酸 | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗体 | 抗p-IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4947 |
| 抗IRF3抗体 | Cell Signaling Technology | 4302 | |
| 抗p-TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 5483 | |
| 抗TBK1抗体 | Cell Signaling Technology | 3013 | |
| 抗泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936 | |
| 抗K63连接泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 5621 | |
| 抗K48连接泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 8081 | |
| 抗HA抗体 | Biolegend | 901513 | |
| 抗Flag抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166355 | |
| 抗Myc抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47694 | |
| 抗β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 抗JMJD6抗体（Abcam） | Abcam | ab176172 | |
| 抗JMJD6抗体（Proteintech） | Proteintech | 16476-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 质粒构建 | pcDNA3.1/myc-His A载体 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| qPCR | SYBR Premix ExTaq试剂 | TaKaRa | -- |
| Mx3005P实时荧光定量PCR系统 | Agilent Technologies | -- | |
| siRNA合成 | 小干扰RNA | GenePharma | -- |
| 稳转细胞系构建 | pLV-ISRE-Puro载体 | Clontech | -- |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| 筛选 | 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 |
| ELISA | 人IFN-β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0085c |
| 小鼠IFN-β ELISA试剂盒 | MLBio | ml063095 | |
| Western blot | Immobilon-P膜 | Millipore | -- |
| 增强化学发光检测试剂 | Thermo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | 细胞系来源（HEK293T、HeLa）、培养条件（DMEM、10%FBS）、病毒株（VSV-GFP、SeV）及感染剂量（MOI）和时间 阅读提示：材料与方法：病毒和细胞 |
| 基因敲低与敲除 | siRNA序列及浓度、sgRNA序列、转染试剂、筛选药物（嘌呤霉素）及浓度 阅读提示：材料与方法：RNA干扰、CRISPR-Cas9敲除 |
| 过表达与报告基因实验 | 质粒种类及量（报告质粒、表达质粒、内参）、转染试剂及时间、SeV感染时间、双荧光素酶检测 阅读提示：材料与方法：转染和报告基因实验 |
| 蛋白相互作用与降解实验 | 抗体（p-IRF3、IRF3、Myc、Flag等）、免疫共沉淀条件、CHX浓度及时间、MG132浓度、λPPase处理条件 阅读提示：材料与方法：免疫共沉淀和Western blot、体外λ蛋白磷酸酶处理 |
| 体内小鼠实验 | 小鼠品系（C57BL/6J）、年龄（6周龄）、性别（雄性）、每组数量（5只）、piggyBac转座子注射剂量（12μg+4μg）、VSV感染剂量（5×10^7 PFU/只）及途径（尾静脉） 阅读提示：材料与方法：PiggyBac敲低转基因(TG)小鼠 |