转录组数据预处理与差异表达分析
识别角膜损伤修复过程中显著差异表达的基因
从GEO获取GSE193784数据集（8个样本），使用RMA算法进行背景校正、分位数归一化和log2转换，利用limma包进行差异表达分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
角膜上皮修复中的平衡：MAPK-JUN/EGR1/TFAP2A网络调控铁死亡细胞命运
A Balancing Act in Corneal Epithelial Repair: A MAPK-JUN/EGR1/TFAP2A Network Regulates Ferroptotic Cell Fate.
实验完整度
中该研究包括转录组生物信息学分析和体外RT-qPCR验证，但缺少动物模型和功能验证实验，证据层级主要为数据分析和体外表达验证。
主要模型
斑马鱼角膜上皮修复模型（GSE193784） 人角膜上皮细胞系HCE-T
重点核对
Erastin处理浓度：2.5 μmol/L，处理时间：24小时 HCE-T细胞系来源：Procell Life Science & Technology Co., Ltd.，RIKEN编号RCB2280 RT-qPCR内参基因：GAPDH，相对定量方法：2^-ΔΔCt 差异表达基因筛选阈值：|log2FC| > 1，调整后p值 < 0.05 WGCNA模块识别：软阈值β=16，最小模块大小30，deepSplit=2，合并剪切高度0.25
摘要
目的：探讨铁死亡在角膜上皮修复过程中的作用，并阐明其潜在的分子调控机制。方法：本研究基于斑马鱼角膜上皮修复数据集（GSE193784）进行转录组分析。我们将差异表达基因与核心加权基因共表达网络分析（WGCNA）模块取交集，并整合基因本体论（GO）/京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建，以及与FerrDb v2数据库交叉比对，筛选参与修复过程的关键铁死亡相关分子。随后，使用Erastin诱导的人角膜上皮细胞（HCE-T）铁死亡模型，通过RT-qPCR进行体外验证。此外，我们将鉴定的转录组特征与最新的哺乳动物和人类单细胞图谱进行比较，以评估跨物种保守性。结果：共鉴定出252个差异表达基因（DEGs），与antiquewhite1 WGCNA模块（该模块与角膜上皮修复相关性最高）取交集后得到99个重叠基因。功能富集分析显示它们在转录组重编程中发挥重要作用，其中MAPK信号通路显著富集。通过PPI网络和FerrDb v2数据库进一步交叉筛选，确定了三个核心生物学因子：jun、egr1和tfap2a。体外实验验证揭示了它们在铁死亡应激下的差异表达模式：JUN下调、EGR1上调和TFAP2A下调。跨物种生物信息学比较表明，这种MAPK驱动的转录组重编程与哺乳动物和人类角膜修复过程中观察到的过度增殖和高可塑性细胞状态高度一致。结论：本研究发现角膜上皮修复过程中的核心生物学因子JUN、EGR1和TFAP2A与铁死亡密切相关。这表明富集于MAPK通路的关键生物学因子可能通过调控铁死亡来影响角膜上皮修复。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 铁死亡是否参与角膜上皮修复过程，其背后的分子调控机制是什么？
- 核心机制
- MAPK信号通路驱动的转录因子JUN、EGR1和TFAP2A构成调控网络，通过调控铁死亡来平衡细胞死亡与存活，从而影响角膜上皮修复。
- 主要证据
- 基于斑马鱼角膜修复转录组数据（GSE193784）的生物信息学分析（DEGs、WGCNA、富集分析、PPI）和FerrDb v2数据库交叉筛选，以及Erastin诱导HCE-T细胞铁死亡模型中RT-qPCR验证，结果显示EGR1上调，JUN和TFAP2A下调。
- 研究意义
- 本研究为角膜上皮修复提供了新的概念框架，将应激信号与铁死亡调控联系起来，并为时间分辨的角膜愈合治疗策略提供了机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
WGCNA共表达网络构建及关键模块鉴定
识别与角膜上皮修复最相关的基因共表达模块
使用WGCNA包对14,914个基因进行加权共表达网络分析，确定最优软阈值β=16，构建拓扑重叠矩阵，鉴定42个模块，并计算模块与修复性状的相关性，确定antiquewhite1模块为关键模块（共1630个基因）。
重叠基因的功能富集分析
揭示重叠基因参与的生物学过程和通路
对99个重叠基因进行GO和KEGG富集分析，发现MAPK级联调节（BP）、转录调节复合物（CC）、离子通道调节活性（MF）等显著富集，MAPK信号通路为最显著富集的KEGG通路。
PPI网络构建与hub基因筛选
确定网络中的核心节点
利用STRING数据库（置信度>0.4）构建99个基因的PPI网络，使用Cytoscape的cytoHubba插件计算Degree、Closeness和Betweenness等中心性指标，鉴定出15个高置信hub基因。
铁死亡相关hub基因筛选
筛选与铁死亡相关的hub基因
从FerrDb v2数据库收集铁死亡相关基因（驱动子、抑制子、标志物），与15个hub基因取交集，得到3个基因：EGR1（驱动子）、JUN（抑制子）、TFAP2A（抑制子）。
体外铁死亡模型验证hub基因表达
验证hub基因在铁死亡条件下的表达变化
使用Erastin（2.5 μmol/L）处理HCE-T细胞24小时建立铁死亡模型，通过RT-qPCR检测JUN、EGR1和TFAP2A的表达，结果显示EGR1显著上调（p<0.001），JUN和TFAP2A显著下调（p<0.001和p<0.05）。
跨物种比较分析
评估研究结果的跨物种保守性
将斑马鱼模型中的关键信号通路和hub基因与哺乳动物和人类单细胞数据集进行比较，发现MAPK信号和细胞可塑性相关特征与猕猴角膜损伤模型、小鼠损伤模型以及人类角膜单细胞图谱中的过度增殖细胞状态高度一致。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证hub基因表达
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 重组胰岛素 | Beyotime | -- | |
| 人表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 铁死亡诱导 | Erastin | -- | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | GOONIE | 400-100 |
| cDNA合成 | cDNA合成试剂盒 | TIANYA BIO | P1504 |
| RT-qPCR | LightCycler 480实时荧光定量PCR仪 | Roche Diagnostics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与铁死亡诱导 | HCE-T细胞系来源（Procell，RIKEN编号RCB2280）；培养基成分（DMEM/F12 + 5% FBS + 5 μg/mL胰岛素 + 10 ng/mL EGF + 0.5% DMSO + 1%青霉素-链霉素）；Erastin浓度2.5 μmol/L，处理24小时；培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Cell Culture and Ferroptosis Induction' |
| RT-qPCR验证 | 引物序列（见表1）；内参基因GAPDH；相对定量方法2^-ΔΔCt；每组至少三个生物学重复 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Validation of Hub Gene Expression via RT-qPCR' 和 Table 1 |
| 转录组数据分析 | 数据集GSE193784（8个样本）；差异表达阈值|log2FC|>1且调整后p<0.05；WGCNA参数（软阈值β=16，最小模块大小30，deepSplit=2，merge cut height=0.25） 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Research Framework and Data Curation', 'DEGs Screening and Key Module Identification' |