验证FOXM1在乳腺癌中的表达及预后意义
确认FOXM1在乳腺癌中高表达及其与患者预后的关系。
利用TCGA数据库和HPA数据库分析FOXM1表达及蛋白水平，在多个乳腺癌细胞系中通过qRT-PCR和Western blot检测FOXM1表达，通过Kaplan-Meier分析生存关系，并通过DUB抑制剂处理评估DUB酶活性对FOXM1的影响，利用UbiBrowser预测上游DUB。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
泛素特异性蛋白酶5通过去泛素化稳定Forkhead box M1促进乳腺癌进展
Ubiquitin-specific protease 5 promotes breast cancer progression by stabilizing Forkhead box M1 through deubiquitination.
实验完整度
高该研究包含体外细胞实验、体内裸鼠移植瘤模型和生物信息学分析，并进行了功能验证和机制验证（去泛素化）。
主要模型
MDA-MB-231细胞 BT-20细胞 裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
USP5与FOXM1的内源性相互作用（通过Co-IP验证） USP5通过去泛素化增强FOXM1稳定性（需要CHX和MG132处理时间及浓度） USP5 C335A突变体失去增强FOXM1表达的能力 FOXM1敲低逆转USP5过表达对细胞增殖和迁移的促进作用
摘要
目的：乳腺癌仍然是女性中领先且侵袭性的癌症。尽管早期治疗有所改善，但快速肿瘤增殖、转移和耐药等挑战仍然存在。本研究探讨去泛素化酶泛素特异性蛋白酶5（USP5）如何维持Forkhead box M1（FOXM1）蛋白稳定性及其对乳腺癌进展的影响。材料与方法：利用癌症基因组图谱数据研究乳腺癌中USP5和FOXM1的表达模式和相互作用。对乳腺癌细胞系进行功能检测，包括侵袭、迁移和增殖。使用实时定量聚合酶链反应、Western blot和免疫共沉淀分析检测USP5和FOXM1的表达和相互作用。进行蛋白质稳定性和泛素化实验以评估USP5对FOXM1稳定性的影响。结果：USP5通过去泛素化稳定FOXM1蛋白。USP5过表达增加FOXM1水平，而USP5敲低加速FOXM1降解。去泛素化酶USP5抑制FOXM1的蛋白酶体降解，增强其稳定性。功能实验表明，USP5过表达促进乳腺癌细胞进展，而USP5敲低抑制这些恶性表型。体内分析显示，FOXM1敲低减少肿瘤体积，USP5过表达联合FOXM1敲低增加肿瘤大小。研究结果表明USP5通过调节FOXM1稳定性促进乳腺癌进展。结论：USP5通过去泛素化稳定FOXM1增强乳腺癌进展。关键词：乳腺癌，去泛素化酶，Forkhead box M1，蛋白质稳定性，泛素特异性蛋白酶5
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- USP5是否通过去泛素化调节FOXM1蛋白稳定性从而促进乳腺癌进展？
- 核心机制
- USP5通过与FOXM1相互作用并去泛素化，抑制其蛋白酶体降解，从而稳定FOXM1蛋白，进而促进乳腺癌细胞增殖和迁移。
- 主要证据
- 通过Co-IP验证内源性相互作用，通过泛素化实验显示USP5过表达降低FOXM1泛素化水平而敲低增加，通过CHX实验显示USP5影响FOXM1半衰期，通过功能实验和移植瘤模型证实USP5-FOXM1轴促进肿瘤生长。
- 研究意义
- 阐明USP5-FOXM1轴在乳腺癌进展中的作用，为靶向该通路的新型治疗策略提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证USP5与FOXM1的相互作用
验证USP5是否与FOXM1直接结合。
在MDA-MB-231和BT-20细胞中通过Co-IP实验检测内源性相互作用。
分析USP5对FOXM1表达的调控及稳定性
验证USP5是否在蛋白水平上调FOXM1并增强其稳定性。
在MDA-MB-231细胞中过表达USP5，在BT-20细胞中敲低USP5，检测FOXM1 mRNA和蛋白水平；通过CHX实验测定FOXM1半衰期。
验证USP5通过去泛素化稳定FOXM1
证明USP5通过其去泛素化酶活性去除FOXM1的泛素链，抑制蛋白酶体降解。
使用MG132抑制蛋白酶体，检测USP5对FOXM1表达的影响；使用USP5催化失活突变体C335A，验证酶活性必要性；通过内源性泛素化实验检测FOXM1泛素化水平变化。
评估USP5对乳腺癌细胞恶性表型的影响
验证USP5对细胞增殖、迁移和侵袭的促进作用。
通过CCK-8实验检测细胞增殖；通过划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞迁移和侵袭。
验证USP5通过FOXM1发挥功能（功能回复实验）
证明USP5对乳腺癌恶性表型的促进作用依赖于FOXM1。
在MDA-MB-231细胞中设置四组：对照、USP5过表达、FOXM1敲低、USP5过表达+FOXM1敲低，进行CCK-8、划痕和Transwell实验。
体内验证USP5-FOXM1轴对肿瘤生长的影响
在动物模型中验证USP5和FOXM1对肿瘤生长的作用。
将不同处理的MDA-MB-231细胞皮下注射到裸鼠，观察肿瘤体积和重量，进行Ki-67免疫组化染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 达尔伯克改良伊格尔培养基 | Gibco | 12491015 |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 12633012 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140148 | |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 |
| P3000辅助试剂 | Invitrogen | L3000150 | |
| 慢病毒转染 | 嘌呤霉素 | MedChemExpress | HYK1057 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore Sigma | IPVH00010 |
| 抗微管蛋白抗体 | Abcam | ab52866 | |
| 抗USP5抗体 | Abcam | ab154170 | |
| 抗FOXM1抗体 | Abcam | ab207298 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗（山羊抗兔IgG） | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 增强化学发光试剂 | BioSharp | BL520A | |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 |
| 泛素化实验 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Selleck Chemicals | S2619 |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | 15596026CN |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 | |
| PowerUp SYBR Green预混液 | Thermo Fisher Scientific | A57155 | |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| CCK-8实验 | CCK-8溶液 | Beyotime | C0038 |
| 显微镜观察 | 奥林巴斯IX73显微镜 | Olympus Corporation | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（培养基、血清浓度、抗生素浓度、温度和CO2浓度） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、质粒用量、siRNA序列、转染时间和细胞密度 阅读提示：Methods: Cell transfection and plasmid sequences |
| 蛋白互作与泛素化 | MG132浓度和处理时间、Co-IP抗体用量、免疫沉淀条件 阅读提示：Methods: Co-IP and endogenous ubiquitination assay; Figure legends 1j-m, 3k-l |
| 蛋白稳定性分析 | CHX浓度和处理时间点，检测蛋白水平 阅读提示：Methods: Western blot analysis; Figure 2i-l |
| 细胞功能实验 | CCK-8检测时间点（24、48、72小时）、划痕实验细胞密度和检测时间（0、24、48小时）、Transwell实验细胞密度和孵育时间（48小时） 阅读提示：Methods: Cell counting kit-8 assay, Wound healing assay, Transwell migration assay |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、分组、注射细胞数和体积、观察时间和肿瘤测量频率 阅读提示：Methods: Construction of a subcutaneous xenograft mouse model of breast cancer |