单细胞数据分析鉴定巨噬细胞亚群
分析NSCLC肿瘤微环境中巨噬细胞异质性，鉴定SPP1+和CXCL9+ TAM亚群。
整合GSE148071和GSE131907数据集，进行质控、聚类和注释，提取巨噬细胞亚群并分析SPP1+、CXCL9+、CPM+ TAM亚群比例。
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ZFP36L1通过调节CXCL9:SPP1极性促进缺氧条件下非小细胞肺癌进展：一项单细胞转录组研究
ZFP36L1 promotes non-small cell lung cancer progression under hypoxia by modulating CXCL9:SPP1 polarity: A single-cell transcriptomic study.
实验完整度
高包含体外细胞共培养、患者来源类器官模型、巨噬细胞特异性敲除小鼠模型的体内验证，以及ChIP、双荧光素酶等机制实验，证据层级多样。
主要模型
THP-1来源的M0巨噬细胞 A549细胞系 NCI-H2170细胞系 巨噬细胞特异性ZFP36L1敲除小鼠模型 患者来源的类器官
重点核对
THP-1细胞用150 nM PMA诱导分化48小时形成M0巨噬细胞 缺氧条件为1% O2、5% CO2和94% N2，处理48小时 在共培养系统中，巨噬细胞与肿瘤细胞以1:5的比例共培养48小时 本研究使用的小鼠为C57BL/6J背景的LysM-Cre; Zfp36l1^fl/fl^敲除小鼠，皮下注射1×10^6 LLC细胞 SPP1和CXCL9的表达变化通过qRT-PCR、Western blot和免疫荧光验证
摘要
背景：非小细胞肺癌（NSCLC）是主要的肺癌亚型，死亡率高。耐药性和免疫逃逸限制了其治疗效果。致癌基因ZFP36L1在NSCLC中的具体机制仍不清楚。方法：使用生物信息学方法分析scRNA-seq数据。通过qRT-PCR、Western blot（WB）、免疫荧光、流式细胞术和ELISA评估缺氧诱导的巨噬细胞CXCL9:SPP1比例的变化。使用双荧光素酶报告基因和ChIP实验验证ZFP36L1介导的SPP1转录调控。在巨噬细胞和NSCLC细胞的共培养系统中，通过流式细胞术、CCK-8、Transwell、集落形成和划痕实验评估肿瘤细胞的恶性程度。患者来源的类器官与巨噬细胞共培养，通过H&E、EdU和CellTiter-Glo实验分析病理变化、增殖和活力，以及通过qRT-PCR和WB分析凋亡相关蛋白的表达。最后，通过巨噬细胞特异性ZFP36L1敲除小鼠模型，在体内验证了ZFP36L1在CXCL9:SPP1极性和NSCLC进展中的功能。结果：缺氧诱导巨噬细胞CXCL9:SPP1比例失衡，促肿瘤的SPP1+巨噬细胞增多，抗肿瘤的CXCL9+巨噬细胞减少。ZFP36L1上调促进巨噬细胞向SPP1+表型极化，进而与肿瘤细胞上的CD44结合加速NSCLC进展。结论：在缺氧条件下，ZFP36L1转录调控SPP1，降低巨噬细胞CXCL9:SPP1比例，从而驱动NSCLC恶性进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ZFP36L1如何调控巨噬细胞CXCL9:SPP1极性，并促进非小细胞肺癌在缺氧条件下的恶性进展？
- 核心机制
- 缺氧上调ZFP36L1，转录调控SPP1表达，使巨噬细胞极化为SPP1+表型，分泌SPP1与肿瘤细胞表面CD44结合，从而促进NSCLC恶性进展。
- 主要证据
- 体外共培养、类器官模型和巨噬细胞特异性敲除小鼠模型显示，ZFP36L1过表达促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，抑制凋亡，而SPP1敲低或抗体阻断可逆转这些效应，且SPP1+巨噬细胞通过CD44结合发挥作用。
- 研究意义
- 该研究确立了ZFP36L1在NSCLC中的致癌作用，并提示其可能作为治疗靶点，为基于巨噬细胞极化的干预策略提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外验证缺氧对巨噬细胞极性及肿瘤细胞恶性表型的影响
验证缺氧是否降低巨噬细胞CXCL9:SPP1比例并促进NSCLC细胞恶性行为。
将PMA诱导的M0巨噬细胞分别置于常氧或缺氧条件下培养，随后与A549或NCI-H2170细胞共培养，检测巨噬细胞极化标志物及肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。
筛选并验证ZFP36L1对巨噬细胞极性的调控
筛选调控CXCL9:SPP1比例的关键转录因子，并验证ZFP36L1对SPP1的转录调控作用。
通过数据库筛选和差异表达分析确定ZFP36L1，在巨噬细胞中敲低ZFP36L1，检测SPP1、CXCL9表达及下游分泌因子变化；通过ChIP和双荧光素酶报告基因实验验证ZFP36L1结合SPP1启动子并促进其转录。
功能验证ZFP36L1-SPP1轴在体外共培养系统中的作用
验证ZFP36L1通过SPP1调控巨噬细胞极性并影响肿瘤细胞恶性表型。
在THP-1细胞中过表达ZFP36L1并敲低SPP1，然后将缺氧处理的巨噬细胞与A549或NCI-H2170细胞共培养，检测肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡；使用SPP1单克隆抗体进一步验证。
类器官模型验证
验证ZFP36L1-SPP1轴在患者来源类器官中的功能。
将不同处理的M0巨噬细胞与患者来源NSCLC类器官在缺氧下共培养，通过H&E、EdU和CellTiter-Glo检测病理变化、增殖和活力，并检测凋亡相关蛋白。
验证SPP1-CD44相互作用对肿瘤恶性表型的影响
验证SPP1+巨噬细胞通过SPP1与肿瘤细胞表面CD44结合促进NSCLC进展。
在共培养系统中加入CD44单克隆抗体，检测肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡；通过IF和IHC分析SPP1与CD44表达。
体内动物模型验证
验证巨噬细胞特异性敲除ZFP36L1对NSCLC进展的影响。
使用LysM-Cre; Zfp36l1^fl/fl^小鼠皮下注射LLC细胞，监测肿瘤生长，通过IHC、IF和ELISA分析肿瘤微环境中相关蛋白和细胞因子表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| β-巯基乙醇 | Maokangbio | -- | |
| F-12K培养基 | Gibco | -- | |
| DMEM-H培养基 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| 细胞分化 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养（低氧） | 三气培养箱 | Thermo Fisher | -- |
| 细胞转染 | 脂质体3000 | Invitrogen | -- |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript Q RT SuperMix试剂盒 | Vazyme | -- | |
| SYBR Green预混液 | MCE | -- | |
| ABI 7500实时荧光定量PCR系统 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 上样缓冲液 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Tanon-4600成像系统 | Biotanon | -- | |
| 抗CXCL9抗体（兔） | Abcam | ab290643 | |
| 抗SPP1抗体（小鼠） | Invitrogen | MA5-17180 | |
| 抗ZFP36L1抗体（兔） | Abcam | ab230507 | |
| 抗MMP9抗体（兔） | Abcam | ab76003 | |
| 抗MMP12抗体（兔） | Invitrogen | MA5-24851 | |
| 抗Caspase 3抗体（兔） | Abcam | ab32351 | |
| 抗Bcl-2抗体（兔） | Abcam | ab182858 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体（兔） | Abcam | ab213262 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（HRP） | Abcam | ab205719 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（HRP） | Abcam | ab6721 | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | -- |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 抗CXCL9抗体（兔） | Invitrogen | 701117 | |
| 抗SPP1抗体（兔） | Proteintech | 22952-1-AP | |
| 抗F4/80抗体（小鼠） | Santa Cruz Biotechnology | sc-377009 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Alexa Fluor 488） | Abcam | ab150113 | |
| 山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor 555） | Abcam | ab150078 | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC和PI | MCE | HY-K1073 |
| 抗CXCL9抗体（ab290643） | Abcam | ab290643 | |
| 山羊抗兔IgG Fc（Alexa Fluor 750） | Abcam | ab175735 | |
| 抗SPP1抗体 | Thermo Fisher | 6696-RBM3-P0 | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| IL-7 ELISA试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| 酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| CCK-8 | CCK-8试剂 | Beyotime | -- |
| 集落形成 | 结晶紫 | Beyotime | -- |
| Transwell | Transwell系统 | Corning | -- |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| ChIP | 蛋白A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 |
| 抗ZFP36L1抗体 | Invitrogen | ZFP36L1-101AP | |
| IgG同型对照 | Abcam | ab313801 | |
| 双荧光素酶报告 | pGL4Luc-RLuc载体 | Novopro | -- |
| 双荧光素酶试剂盒 | Promega | -- | |
| 类器官培养 | II型胶原酶 | Thermo Fisher | -- |
| IV型胶原酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 分散酶II | Beyotime | -- | |
| Y-27632 | MCE | -- | |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| N-乙酰-L-半胱氨酸 | Yeasen | -- | |
| 胃泌素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| Noggin | -- | -- | |
| R-spondin | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 烟酰胺 | -- | -- | |
| A83-01 | -- | -- | |
| 成纤维细胞生长因子10 | MCE | -- | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher | -- | |
| HEPES | Thermo Fisher | -- | |
| N2补充剂 | Thermo Fisher | -- | |
| B27补充剂 | Thermo Fisher | -- | |
| EdU染色 | EdU工作液 | Solarbio | CA1170 |
| 点击反应混合物 | Beyotime | -- | |
| CellTiter-Glo | CellTiter-Glo试剂盒 | Promega | G7570 |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | GemPharmatech | -- |
| 巨噬细胞分离 | 红细胞裂解液 | Beyotime | -- |
| 抗F4/80抗体（11-4801-82） | Invitrogen | 11-4801-82 | |
| 免疫组化 | 福尔马林 | Maokangbio | -- |
| 柠檬酸钠缓冲液 | Meilunbio | -- | |
| 过氧化氢 | Maokangbio | -- | |
| 牛血清白蛋白 | MCE | -- | |
| DAB底物试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 抗ZFP36L1抗体（兔） | Cusabio | CSB-PA004298 | |
| 抗CXCL9抗体（兔） | Abcam | ab320827 | |
| 抗SPP1抗体（兔） | Abcam | ab218237 | |
| 抗CD44抗体（兔） | Abcam | ab243894 | |
| 抗Ki67抗体（兔） | Abcam | ab16667 | |
| 功能验证 | SPP1单克隆抗体 | MCE | HY-P80771 |
| CD44单克隆抗体 | MCE | HY-P80062 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞数据分析 | 数据来源GSE148071和GSE131907，质控标准（nFeature>100，线粒体基因<15%，排除nCount>50000或nFeature>7000） 阅读提示：见Methods 2.1和2.2节，以及Figure S1 |
| 细胞培养与分化 | THP-1细胞用PMA浓度150 nM处理48小时；缺氧条件1% O2、5% CO2、94% N2，处理48小时；共培养比例1:5，时间48小时 阅读提示：见Methods 2.7节 |
| 基因操作 | sh-ZFP36L1、oe-ZFP36L1等质粒由GenePharma合成，转染试剂Lipofectamine 3000，转染时间48小时 阅读提示：见Methods 2.8节 |
| 分子检测 | qRT-PCR引物序列见表1；Western blot抗体列表见表2；免疫荧光抗体见表3；流式细胞术使用Annexin V-FITC和PI 阅读提示：见Methods 2.9–2.12节及相应表格 |
| 类器官实验 | 类器官培养条件：Matrigel包被，培养基组成（N-acetyl-L-cysteine 1 mM，gastrin 10 nM，Noggin 0.1 μg/mL，R-spondin 1 μg/mL，EGF 50 ng/mL，nicotinamide 10 mM，A83-01 0.5 μM，FGF10 100 ng/mL），共培养时间48小时 阅读提示：见Methods 2.21–2.23节 |
| 动物实验 | 小鼠数量12只（每组6只），皮下注射1×10^6 LLC细胞，肿瘤体积监测时间点第7、14、21、28天，第28天处死 阅读提示：见Methods 2.27节及Figure 8 |