数据获取与预处理
获取骨肉瘤基因表达和临床数据，为模型构建提供输入。
从GEO下载GSE21257和GSE16091表达矩阵，分别用GPL10295和GPL96注释。
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基于机器学习和实验建立m6A相关分子模式在骨肉瘤预后和免疫浸润中的作用
Establishment of a m6A-Related Molecular Pattern in the Prognosis and Immune Infiltration of Osteosarcoma Using Machine Learning and Experiments.
实验完整度
中包含生物信息学模型构建与验证，以及TRAP1基因敲除的体外功能实验，但缺乏体内动物模型验证。
主要模型
骨肉瘤细胞系143B 骨肉瘤细胞系U2OS 骨肉瘤细胞系MG-63 人成骨细胞系hFOB1.19 GEO数据集GSE21257和GSE16091
重点核对
训练集：GSE21257中70%随机样本；内部测试集：剩余30%；外部测试集：GSE16091全部样本 采用弹性网络惩罚Cox回归，λmin=0.2799，λlse=0.7096 风险评分分组：以中位数为界划分高低风险组 TRAP1敲除实验：使用CRISPR/Cas9，sgRNA序列见表S1，经嘌呤霉素筛选 细胞增殖检测：CCK-8，每孔2000细胞；克隆形成实验：每孔500细胞，培养14天；凋亡检测：Annexin V-PE和7-AAD染色
摘要
背景：为了确定骨肉瘤的预后，近年来已构建了多种预测模型。然而，对于骨肉瘤的关键分子调控因子亚群——N6-甲基腺苷（m6A）相关基因的模型尚未被确定。方法：从GEO数据集GSE21257和GSE16091中提取基因表达矩阵和临床数据。随机选择GSE21257中70%的样本作为训练数据集，其余30%的GSE21257样本和GSE16091的所有样本分别作为内部测试和外部测试数据集。使用弹性网络惩罚Cox回归开发预测模型。在训练、内部测试和外部测试数据集中进行了受试者工作特征（ROC）分析、Kaplan-Meier分析和Wilcoxon检验以验证其有效性。此外，建立了临床列线图用于预后预测。在骨肉瘤细胞系和临床样本中验证了几个特征基因的表达。进行体外实验以阐明特征基因对骨肉瘤表型的影响。进一步整合免疫浸润分析和基因集富集分析（GSEA）以验证风险模型区分癌症特征的能力。结果：从GSE21257中鉴定出总共110个m6A相关且与生存显著相关的基因。其中，最终有14个基因被纳入骨肉瘤的预后模型。ROC分析显示，训练、内部测试和外部测试数据集中的AUC值分别为0.8304、0.9091和0.7123。此外，预测1年、3年和5年总生存期的AUC值分别为0.8827、0.8709和0.7664，总AUC为0.8275。在此框架下，成功构建了临床列线图。值得注意的是，免疫浸润分析显示高风险组的免疫评分降低。GSEA显示高风险组中富集了几个众所周知的恶性肿瘤相关基因集，包括E2F靶基因、MYC靶基因、有丝分裂纺锤体和缺氧相关通路等。结论：基于m6A相关基因的预后模型被开发出来，该模型在预测骨肉瘤预后方面表现出强大的效力。此外，产生了稳健的临床列线图，为支持临床决策和个性化治疗提供了新的证据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一个基于m6A相关基因的预后模型，用于预测骨肉瘤患者的生存并区分免疫浸润特征。
- 核心机制
- 高风险组富集E2F靶基因、MYC靶基因、有丝分裂纺锤体和缺氧等肿瘤促进通路，抑制干扰素γ反应和凋亡等肿瘤抑制通路。
- 主要证据
- 基于GSE21257和GSE16091数据集的弹性网络Cox回归模型，结合ROC、KM和外部验证；并通过RT-qPCR验证MCAM、NNT、SLC7A1和TRAP1在骨肉瘤细胞系中过表达，且TRAP1敲除抑制增殖并促进凋亡。
- 研究意义
- 该模型和列线图可预测骨肉瘤预后，可能有助于临床决策和个体化治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选生存相关m6A基因
识别与总生存显著相关的m6A相关基因。
使用Kaplan-Meier分析筛选生存相关基因，与GeneCards数据库的m6A相关基因取交集。
构建弹性网络Cox回归模型
筛选预测基因并构建预后模型。
对110个交集基因进行弹性网络惩罚Cox回归，确定最优λ并选择模型基因。
模型验证
评估模型的预测效能。
在训练、内部测试和外部测试数据集中进行ROC、KM和Wilcoxon检验。
构建列线图
可视化个体生存概率预测。
基于风险组、年龄、性别、Huvos分级和转移构建列线图，并用校准曲线评估。
免疫浸润和GSEA分析
评估风险模型区分肿瘤微环境和通路激活的能力。
使用CIBERSORT和XCELL评估免疫浸润，GSEA分析通路富集。
骨肉瘤细胞系中验证特征基因表达
验证模型基因在细胞系中的表达差异。
通过RT-qPCR检测MCAM、NNT、SLC7A1和TRAP1的表达。
TRAP1功能实验
探究TRAP1对骨肉瘤细胞表型的影响。
通过CRISPR/Cas9敲除TRAP1，检测细胞增殖、克隆形成和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
模型构建
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| McCoy's 5A培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNA快速提取试剂盒 | NCM Biotech | M050 |
| 逆转录 | RevertAid第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | K1622 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Vazyme | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 抗MCAM抗体 | Proteintech | 17564-1-AP | |
| 抗NNT抗体 | Proteintech | 13442-2-AP | |
| 抗SLC7A1抗体 | Proteintech | 14195-1-AP | |
| 抗TRAP1抗体 | Proteintech | 10325-1-AP | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66240-1-Ig | |
| 二抗（小鼠） | Proteintech | RGAM001 | |
| 二抗（兔） | Proteintech | RGAR001 | |
| ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| 克隆形成 | 结晶紫 | -- | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V-PE | -- | -- |
| 7-AAD | -- | -- | |
| 流式分析 | Cytek NL-CLC流式细胞仪 | -- | -- |
| 质粒构建 | lentiCRISPRv2质粒 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 数据获取与预处理 | 数据集GSE21257和GSE16091的获取，样本量53和34，基因数24998和12546 阅读提示：参见Methods 2.1 |
| 模型构建 | 弹性网络Cox回归的参数，λmin=0.2799，λlse=0.7096，训练集与测试集划分 阅读提示：Methods 2.3, Results 3.1 |
| 细胞培养 | 细胞系来源（hFOB1.19, 143B, U2OS, MG-63），培养基（DMEM, McCoy's 5A），血清浓度（10%），抗生素（1%青霉素-链霉素），培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Methods 2.8 |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒（M050），逆转录试剂盒（K1622），引物序列 阅读提示：Methods 2.9, Table S1 |
| TRAP1敲除 | sgRNA序列（表S1），嘌呤霉素筛选浓度（未明确），敲除验证（Western blot） 阅读提示：Methods 2.10, 2.11, Table S1 |
| 功能实验 | CCK-8实验每孔2000细胞；克隆形成每孔500细胞，培养14天；凋亡检测每孔150,000细胞，转染48小时 阅读提示：Methods 2.12-2.14, 图7 |