ADSC分离、培养和鉴定
验证所获细胞确为具有多向分化潜能的间充质干细胞。
从SD大鼠脂肪组织分离ADSC，培养至P4代，通过流式细胞术检测表面标志物，并诱导成脂和成骨分化。
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脂肪间充质干细胞条件培养基通过抑制肺泡巨噬细胞焦亡减轻脂多糖诱导的急性肺损伤
ADSC-Conditioned Medium Mitigates LPS-Induced Acute Lung Injury by Inhibiting Alveolar Macrophage Pyroptosis.
实验完整度
高包含体内大鼠模型（LPS诱导ALI）和体外NR8383细胞实验，并进行了功能验证（组织病理、ELISA）和机制验证（Western blot、RT-qPCR、TEM、IF）。
主要模型
SD大鼠LPS诱导的ALI模型 NR8383肺泡巨噬细胞系 脂肪间充质干细胞（ADSC）
重点核对
LPS剂量：体内5 mg/kg，体外1 μg/mL ADSC-CM给入方式：尾静脉注射（体内）或共培养（体外） ADSC-CM制备：血清和生长因子-free DMEM培养48小时，浓缩至约20× TLR4抑制剂TAK-242浓度：100 nM 实验组设置：CON、LPS、LPS+CM、LPS+TAK、LPS+CM+TAK
摘要
急性肺损伤（ALI）以严重的肺部炎症和高死亡率为特征，然而特异性药物干预仍十分有限。脂肪间充质干细胞条件培养基（ADSC-CM）代表一种新型的无细胞策略，具有巨大的治疗潜力。本研究探讨了ADSC-CM在脂多糖（LPS）诱导的ALI大鼠模型中的保护作用。全身性给予ADSC-CM显著减轻了肺部病理损伤，降低了全身炎症细胞因子水平，并抑制了肺组织内的焦亡。机制上，使用NR8383肺泡巨噬细胞（AM）细胞系的体外研究表明，ADSC-CM抑制了TLR4/MyD88/NF-κB信号轴和NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的焦亡级联反应。这些效应主要通过下调TLR4表达驱动，尽管其他分子靶点也可能参与这一保护作用。我们的研究结果强调了ADSC-CM在调节AMs焦亡和炎症反应中的治疗功效，为开发ADSC-CM作为治疗ALI的无细胞治疗平台提供了强有力的机制依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ADSC-CM是否能够减轻LPS诱导的急性肺损伤，其机制是否涉及抑制肺泡巨噬细胞焦亡？
- 核心机制
- ADSC-CM通过下调TLR4表达，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号轴和NLRP3/Caspase-1/GSDMD介导的焦亡级联反应，从而减轻肺组织炎症和损伤。
- 主要证据
- 在大鼠模型中，ADSC-CM显著降低了肺损伤评分、W/D比值和炎症因子水平，并抑制了肺组织焦亡标志物；在NR8383细胞中，ADSC-CM抑制了LPS诱导的焦亡，且与TAK-242联合时进一步下调NLRP3、GSDMD和IL-18。
- 研究意义
- ADSC-CM作为一种无细胞治疗策略，为ALI的治疗提供了机制上的理论基础，并提示其作为临床干预手段的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ADSC-CM制备
获得富含分泌因子的条件培养基。
P4代ADSC在无血清无生长因子DMEM中培养48小时，收集上清并浓缩。
体内大鼠ALI模型建立及ADSC-CM治疗
评估ADSC-CM对LPS诱导的ALI的保护作用。
SD大鼠腹腔注射LPS诱导ALI，随后尾静脉注射ADSC-CM，24小时后处死，采集血液和肺组织。
肺组织病理及水肿评估
评估ADSC-CM对肺组织损伤和水肿的影响。
通过H&E染色评估肺组织病理学改变，并计算肺湿干比。
肺组织焦亡相关蛋白和基因表达检测
检测ADSC-CM对LPS诱导的肺组织焦亡通路蛋白和mRNA表达的影响。
Western blot检测TLR4、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1β蛋白水平；RT-qPCR检测相应mRNA水平。
体外NR8383细胞模型及ADSC-CM处理
进一步验证ADSC-CM对LPS诱导的肺泡巨噬细胞焦亡的抑制作用及其机制。
NR8383细胞分为CON、LPS、LPS+CM、LPS+TAK、LPS+CM+TAK组，通过TEM、IF和Western blot/RT-qPCR检测焦亡相关标志。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞分离培养 | I型胶原酶 | BioFroxx | -- |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | WILBER | -- |
| T25培养瓶 | Corning | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | CAPRICORN | -- | |
| 青霉素 | Solarbio | -- | |
| 链霉素 | Solarbio | -- | |
| 细胞表型鉴定 | CD29抗体 | BioLegend | -- |
| CD44h抗体 | BioLegend | -- | |
| CD45抗体 | BioLegend | -- | |
| CD90抗体 | BioLegend | -- | |
| 分化诱导 | 成脂诱导培养基 | Procell | -- |
| 成骨诱导培养基 | Procell | -- | |
| ADSC-CM制备 | Amicon Ultra-10离心过滤装置 | Merck Millipore | -- |
| 动物实验 | 脂多糖 | Beyotime | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | mlbio | -- |
| 细胞培养 | NR8383细胞完全培养基 | Procell | -- |
| 细胞处理 | TAK-242 | SparkJade | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Yeasen | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| GSDMD抗体 | Proteintech | 20770-1-AP | |
| NLRP3抗体 | Proteintech | 68102-1-Ig | |
| DAPI | Agbio | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Beyotime | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Mei5bio | -- | |
| 预染蛋白marker | Servicebio | G2091 | |
| 硝酸纤维素膜 | Biosharp | -- | |
| 脱脂奶粉 | BioFroxx | -- | |
| TLR4抗体 | Abcam | ab22048 | |
| MyD88抗体 | Wanleibio | WL02494 | |
| IKKα/β抗体 | Wanleibio | WL01900 | |
| NF-κB抗体 | Affinity | BF8005 | |
| NLRP3抗体 | Affinity | BF8029 | |
| Pro Caspase-1抗体 | Immunoway | YM8437 | |
| Caspase-1抗体 | Wanleibio | WL03450 | |
| GSDMD抗体 | Affinity | AF4012 | |
| IL-1β抗体 | Immunoway | YM8498 | |
| IL-18抗体 | Proteintech | 60070-1-Ig | |
| HRP标记二抗（兔） | Affinity | S0001 | |
| HRP标记二抗（鼠） | Affinity | S0002 | |
| 化学发光成像系统 | Servicebio | -- | |
| RNA提取 | RNAiso Easy试剂盒 | Takara Bio | -- |
| RT-qPCR | Evo M-MLV RT mix试剂盒 | -- | -- |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Agbio | -- | |
| 引物 | Genesoul Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | LPS剂量、给药途径（腹腔注射）、ADSC-CM剂量（来自1.5×10^6细胞浓缩物）、给药途径（尾静脉注射）、时间（24小时）、每组样本量n=10 阅读提示：见Materials and Methods 2.3节 |
| ADSC-CM制备 | 细胞培养密度、无血清DMEM孵育时间（48小时）、浓缩倍数（约20×） 阅读提示：见Materials and Methods 2.2节 |
| NR8383细胞处理 | LPS浓度（1 μg/mL）、处理时间（6小时）、ADSC-CM添加量（来自1.25×10^6细胞）、TAK-242浓度（100 nM）、预孵育时间（1小时） 阅读提示：见Materials and Methods 2.7节 |
| 蛋白表达检测 | 抗体使用浓度、孵育时间、内参蛋白（GAPDH） 阅读提示：见Materials and Methods 2.10节 |
| mRNA表达检测 | RNA提取方法、反转录体系、qPCR条件、引物序列、内参基因（GAPDH） 阅读提示：见Materials and Methods 2.11节及Table 1 |