冷暴露模型建立及TRPC6表达分析
鉴定BAT中响应冷刺激的潜在调节因子，特别是TRPC通道家族成员的表达变化。
将野生型小鼠置于4°C冷暴露7天，通过RNA-seq、western blot和免疫组化分析BAT中TRPC6的表达和定位。
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TRPC6通过BMPR2-p38 MAPK信号轴控制棕色脂肪产热
TRPC6 governs brown adipose thermogenesis via a BMPR2-p38 MAPK signaling axis.
实验完整度
高包含BAT特异性敲除小鼠的体内模型、原代棕色脂肪细胞及C3H10T1/2细胞体外模型，并进行了功能验证（冷耐受、能量代谢）和机制验证（p38 MAPK、BMPR2相互作用）。
主要模型
BAT特异性Trpc6敲除小鼠（Trpc6BTKO） 原代棕色脂肪细胞（来自Trpc6+/+和Trpc6−/−小鼠） C3H10T1/2来源的棕色脂肪细胞
重点核对
BAT特异性Trpc6敲除小鼠（Trpc6BTKO）的构建及敲除效率验证 高脂饮食（HFD，60%脂肪）诱导的肥胖模型，处理时间12-16周 冷暴露实验（4°C，7天）评估耐寒性和产热 TRPC6激动剂hyperforin（HPF，5 μM）处理验证钙依赖性p38激活 BMPR2敲低（si-Bmpr2）实验验证机制必需性
摘要
棕色脂肪组织（BAT）产热对抗肥胖，但将钙动态与产热程序联系起来的机制仍不完全清楚。在此，我们确定钙通道TRPC6是代谢健康的必需BAT内在调节因子。BAT特异性Trpc6敲除（Trpc6BTKO）小鼠表现出自发性BAT变白、线粒体功能障碍和耐寒性受损。在高脂饮食（HFD）刺激下，Trpc6BTKO小鼠出现更严重的肥胖、肝脂肪变性和胰岛素抵抗。这些表型是由能量摄入增加和与产热受损相关的能量消耗减少驱动的。TRPC6缺乏抑制线粒体生物发生和产热。机制上，TRPC6介导钙内流并与BMPR2直接相互作用，从而选择性激活p38 MAPK信号以驱动产热基因表达。TRPC6-BMPR2复合物的遗传破坏消除了TRPC6介导的产热。因此，我们定义了一个非冗余的TRPC6-BMPR2-p38 MAPK信号轴，其破坏是肥胖和相关代谢功能障碍的基础，将其定位为代谢疾病的有前景的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRPC6是否以及如何调控棕色脂肪组织（BAT）的产热功能，并影响全身代谢健康？
- 核心机制
- TRPC6通过介导钙内流并与BMPR2直接相互作用，选择性激活p38 MAPK信号通路，进而驱动PGC-1α/UCP1产热基因的表达。
- 主要证据
- BAT特异性Trpc6敲除小鼠表现出BAT变白、线粒体功能障碍、冷耐受受损及HFD诱导的肥胖加重；原代棕色脂肪细胞和C3H10T1/2细胞中TRPC6敲低/过表达实验及药理学激活实验进一步证实了TRPC6在产热中的核心作用，并验证了TRPC6-BMPR2-p38 MAPK轴的因果性。
- 研究意义
- 该研究揭示了TRPC6-BMPR2-p38 MAPK信号轴作为肥胖和代谢疾病潜在治疗靶点的可能性，为开发针对该通路的干预策略提供了理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BAT特异性Trpc6敲除小鼠表型分析
评估BAT特异性TRPC6缺失对能量代谢、肥胖和冷耐受的影响。
将Trpc6fl/fl小鼠与UCP1-Cre小鼠杂交获得Trpc6BTKO小鼠，在正常饮食和高脂饮食条件下监测体重、体脂、食物摄入、能量消耗、葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，并进行冷暴露实验。
线粒体功能与产热基因表达分析
探究TRPC6缺失对BAT线粒体生物发生、功能和产热基因表达的影响。
通过western blot、qPCR、免疫组化、mtDNA定量和透射电镜分析BAT中产热蛋白（UCP1、PGC-1α）和OXPHOS复合物水平、线粒体DNA拷贝数及超微结构。
体外细胞模型验证
在细胞水平验证TRPC6对棕色脂肪细胞产热功能的影响及其机制。
分离并分化原代棕色脂肪细胞，以及C3H10T1/2细胞，通过基因敲低/过表达、钙成像、Seahorse代谢分析等方法检测TRPC6功能。
机制研究：TRPC6-BMPR2-p38 MAPK轴
阐明TRPC6调控产热的分子机制，特别是其与BMPR2的相互作用及对p38 MAPK信号通路的调控。
通过分子对接、免疫共沉淀、免疫荧光证明TRPC6与BMPR2的相互作用，通过western blot检测p38 MAPK、ERK、JNK的磷酸化水平，并通过BMPR2敲低和p38激动剂DHC实验验证通路依赖性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | UCP1-Cre小鼠 | Model Animal Research Center of Nanjing University | -- |
| Trpc6fl/fl小鼠 | GemPharmatech Co., Ltd | -- | |
| 高脂饲料（60%脂肪） | Xietong Biotech | XTHF60 | |
| 体成分分析 | 小动物体成分分析仪 | Niumag | QMR20-060H-I |
| 代谢笼 | 代谢笼系统 | Sable Systems | PRO-MRM-4 |
| 红外热成像 | 热成像仪 | Fotric | 323Pro |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Accurate Biology | AG21024 |
| cDNA合成 | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11706 |
| qPCR | AG qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 |
| DNA提取 | 通用基因组DNA提取试剂盒 | Servicebio | G3633 |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Cwbio | CW2333S |
| 蛋白酶抑制剂 | 蛋白酶抑制剂 | Cwbio | CW2200S |
| 磷酸酶抑制剂 | 磷酸酶抑制剂 | Cwbio | CW2383S |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| Western blot | 上样缓冲液 | Fude | FD002 |
| PVDF膜 | Millipore | IPFL00005 | |
| 脱脂牛奶 | Epizyme | PS112 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Millipore | WBULS0100 | |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 抗FLAG抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| Protein A/G磁珠 | MCE | HY-K0202 | |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | Sakura | 4583 |
| 冰冻切片机 | Leica | CM1950 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Boster | AR0030 | |
| Triton X-100 | Solarbio | IT9100 | |
| 山羊血清 | Boster | AR0009 | |
| 二抗（AlexaFluor488） | Invitrogen | A-11008 | |
| 二抗（AlexaFluor568） | Invitrogen | A-11004 | |
| DAPI | Solarbio | S2110 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | Ti2-E | |
| 组织病理 | 数字病理切片扫描仪 | 3D HISTECH | -- |
| 免疫组化 | UCP1抗体 | Abcam | ab234430 |
| PGC-1α抗体 | Abclonal | A20995 | |
| HRP标记二抗 | Epizyme | LF102 | |
| DAB显色试剂盒 | Zsgb Biotech | ZLI-9017 | |
| 细胞培养 | C3H10T1/2细胞 | Procell Life Science & Technology Co., Ltd | CL-0325 |
| 高糖DMEM培养基 | Gibco | C11995500BT | |
| 胎牛血清 | ExCell | FSP500 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 细胞分化 | 地塞米松 | Sigma | D1756 |
| IBMX | TargetMol | 28822-58-4 | |
| 吲哚美辛 | Macklin | 53-86-1 | |
| 胰岛素 | Solarbio | I8830 | |
| 罗格列酮 | Macklin | R832516 | |
| 三碘甲状腺原氨酸（T3） | Sigma | T2877 | |
| 细胞染色 | Bodipy染色 | MCE | HY-W090090 |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 | |
| 油红O染色试剂盒 | Beyotime | C0158S | |
| 分子克隆 | sh-Trpc6慢病毒载体 | GeneChem Co., Ltd | -- |
| Trpc6过表达载体 | GenePharma Co., Ltd. | -- | |
| TRPC6-Flag-eGFP载体 | IGE Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| siRNA转染 | Bmpr2 siRNA | GenePharma Co., Ltd | -- |
| siRNA-mate plus转染试剂 | GenePharma Co., Ltd | -- | |
| 原代细胞分离 | 分散酶II | Sigma | D4693 |
| II型胶原酶 | Sigma | 9001-12-1 | |
| 氯化钙 | Macklin | 10043-52-4 | |
| 药物处理 | 金丝桃素（HPF） | MCE | HY-116330A |
| 脱氢紫堇碱氯化物（DHC） | MCE | HY-N0674A | |
| 耗氧率测定 | Seahorse XF96分析仪 | Agilent Technologies | 103015-100 |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 抗霉素/鱼藤酮 | -- | -- | |
| 钙成像 | Fluo-4 AM | Beyotime | S1061S |
| EGTA | Beyotime | ST068 | |
| 透射电镜 | 超薄切片机 | Leica | EM UC7 |
| 透射电子显微镜 | FEI | Talos L120C | |
| RNA测序 | Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BAT特异性Trpc6敲除小鼠模型 | 基因型：Trpc6fl/fl;UCP1-Cre（Trpc6BTKO）与Trpc6fl/fl对照；背景：C57BL/6J；敲除效率验证 阅读提示：见Materials and methods 4.1 Animal experiments |
| 高脂饮食诱导肥胖 | 饮食：60%高脂饲料（XieTong XTHF60）；喂养周期：12-16周；小鼠性别：雄性；年龄：6-8周 阅读提示：见Materials and methods 4.1 Animal experiments |
| 冷暴露实验 | 温度：4°C；暴露时间：7天；小鼠饲养条件（光照周期、食物和水） 阅读提示：见Materials and methods 4.1 Animal experiments，Results 2.3 |
| 能量代谢监测 | 代谢笼：Sable Systems PRO-MRM-4；环境温度：22°C；适应期：24小时；监测时间：48小时；数据归一化：体重 阅读提示：见Materials and methods 4.3 High-definition multiplexed respirometry system |
| 原代棕色脂肪细胞分化 | 小鼠：Trpc6+/+和Trpc6−/−，6-8周龄雄性；消化酶：dispase II (2.4 μg/ml)、collagenase type II (10 mg/ml)、CaCl2 (10 mM)；分化程序 阅读提示：见Materials and methods 4.17 SVF isolation and primary cell culture |
| C3H10T1/2细胞分化 | 细胞系：C3H10T1/2（CL-0325）；诱导培养基成分（地塞米松、IBMX、吲哚美辛、胰岛素、罗格列酮、T3）；分化时间 阅读提示：见Materials and methods 4.14 Cell culture and treatment |
| TRPC6激动剂处理 | HPF浓度：5 μM；处理时间：48小时；对照组：vehicle 阅读提示：见Materials and methods 4.17 SVF isolation and primary cell culture |
| p38激动剂处理 | DHC浓度：1 μM；处理时间：48小时；对照组：vehicle 阅读提示：见Materials and methods 4.17 SVF isolation and primary cell culture |