临床样本分析
评估肝纤维化患者中FAK表达及信号通路变化
收集30例肝纤维化/肝硬化患者和8例对照的肝组织，进行HE、Masson、天狼星红染色、IHC、WB和RNA-seq分析。
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FAK-TRIM25通过抑制FBXW7介导的c-Myc泛素化促进肝星状细胞活化和糖酵解
FAK-TRIM25 promotes HSC activation and glycolysis by inhibiting c-Myc ubiquitination via FBXW7
实验完整度
高包含人肝组织样本、小鼠模型、LX-2细胞等至少两个独立证据层级，并有功能验证（抑制/过表达）和机制验证（Co-IP、泛素化实验）。
主要模型
LX-2细胞 HEK 293T细胞 CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型 人肝纤维化组织样本
重点核对
FAK-TRIM25相互作用的验证：内源性和外源性Co-IP FAK与TRIM25共定位：免疫荧光 TRIM25截短体定位：确定RING、B-BOX、SPRY区域为结合关键 泛素化水平检测：FAK抑制后c-Myc和TRIM25泛素化增加，MG132逆转 体内验证：AAV-TRIM25过表达小鼠模型
摘要
肝纤维化的特征是肝星状细胞（HSC）活化和葡萄糖消耗增加。粘着斑激酶（FAK）上调HSC中c-Myc的表达，促进有氧糖酵解。本研究探讨FAK如何通过TRIM25促进HSC活化和糖酵解。免疫组织化学（IHC）和Western blotting评估了人肝组织和小鼠模型中FAK、TRIM25、FBXW7、c-Myc及糖酵解相关蛋白的表达。通过免疫共沉淀（Co-IP）和LC-MS鉴定蛋白相互作用，并通过免疫荧光观察FAK和TRIM25的定位。FAK抑制减少了LX-2细胞活化、迁移和糖酵解。Co-IP和免疫荧光证实了FAK-TRIM25相互作用。FAK通过结合TRIM25的RING、B-BOX和SPRY区域抑制FBXW7介导的c-Myc泛素化并增强糖酵解。抑制FAK改善了肝纤维化和糖酵解。FAK通过TRIM25相互作用促进HSC糖酵解，其抑制减轻肝纤维化，提示潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FAK如何通过TRIM25调节c-Myc蛋白稳定性，从而促进肝星状细胞活化和有氧糖酵解？
- 核心机制
- FAK与TRIM25的RING、B-BOX和SPRY区域结合，增强TRIM25酪氨酸磷酸化并稳定TRIM25蛋白，进而促进FBXW7的泛素化，抑制c-Myc的泛素化降解，增加c-Myc蛋白稳定性，促进HSC活化和有氧糖酵解。
- 主要证据
- 在人肝纤维化组织、CCl4诱导的小鼠模型和LX-2细胞中，FAK抑制降低TRIM25和c-Myc表达，增加FBXW7表达；Co-IP和免疫荧光证实FAK-TRIM25相互作用；泛素化实验显示FAK促进FBXW7泛素化并抑制c-Myc泛素化。
- 研究意义
- 揭示FAK-TRIM25-FBXW7-c-Myc信号轴在肝纤维化中的新机制，FAK抑制剂可能成为肝纤维化的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物模型验证
验证FAK在肝纤维化和有氧糖酵解中的作用
采用CCl4诱导小鼠肝纤维化模型，给予FAK抑制剂PF562271，评估肝纤维化程度、肝功能、糖酵解相关指标和炎症因子。
细胞模型功能实验
探究FAK对LX-2细胞活化、迁移和糖酵解的影响
在LX-2细胞中通过FAK抑制剂处理或慢病毒过表达FAK，检测活化标志物、迁移能力和糖酵解水平。
分子机制研究
阐明FAK与TRIM25相互作用及对c-Myc泛素化的影响
通过Co-IP、免疫荧光、质谱分析验证FAK-TRIM25相互作用，通过截短体定位结合区域，通过泛素化实验检测对FBXW7和c-Myc泛素化的影响。
TRIM25功能验证
验证TRIM25是否介导FAK在肝星状细胞活化和糖酵解中的作用
在FAK过表达的LX-2细胞中敲低TRIM25，检测通路蛋白、活化标志物、迁移和糖酵解水平。
体内验证TRIM25作用
验证TRIM25在体内对肝纤维化和有氧糖酵解的影响
通过尾静脉注射AAV-TRIM25过表达TRIM25，结合CCl4诱导肝纤维化，观察FAK抑制对病理变化的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 玉米油 | Sigma Aldrich | -- |
| 药物处理 | PF562271 | MedChemExpress | HY10459 |
| Western blot | COL1A1抗体 | Abcam | EPR22894-89 |
| α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | -- | |
| FAK抗体 | Abcam | -- | |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠绿色荧光二抗 | Abcam | -- |
| 山羊抗兔红色荧光二抗 | Abcam | -- | |
| Western blot | TRIM25抗体 | Abcam | -- |
| PKM2抗体 | Chengdu Zhengneng | -- | |
| PFKFB3抗体 | Chengdu Zhengneng | -- | |
| HK-2抗体 | Chengdu Zhengneng | -- | |
| ENO1抗体 | Chengdu Zhengneng | -- | |
| 质粒构建 | TRIM25-His质粒 | GeneChem | -- |
| FAK-3Xflag质粒 | GeneChem | -- | |
| TRIM25-△RING质粒 | GeneChem | -- | |
| TRIM25-△BOX质粒 | GeneChem | -- | |
| TRIM25-△CC质粒 | GeneChem | -- | |
| 质粒提取 | 质粒提取试剂盒 | Beijing Mei5 Biotechnology | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞培养 | 猕猴桃 | Aladdin | -- |
| ELISA | 小鼠脂多糖/内毒素ELISA试剂盒 | Shanghai Animaluni | -- |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Shanghai Animaluni | -- | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Shanghai Animaluni | -- | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Shanghai Animaluni | -- | |
| 病理染色 | Masson染色试剂盒 | Beijing Solebo Company | -- |
| HE染色试剂盒 | Beijing Solebo Company | -- | |
| 天狼星红染色试剂盒 | Beijing Solebo Company | -- | |
| 动物实验 | AAV载体 | Baisheng Lejian Biotechnology Co. | -- |
| AAV-TRIM25病毒 | Baisheng Lejian Biotechnology Co. | -- | |
| siRNA转染 | TRIM25小干扰RNA | Gemma Gene | -- |
| 阴性对照siRNA | Gemma Gene | -- | |
| 蛋白提取 | 总蛋白提取试剂盒 | Abbkine | KTP3006 |
| 代谢检测 | L-乳酸比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M |
| 葡萄糖比色法试剂盒 | Elabscience | E-BC-K234-M | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A/G磁珠 | Shanghai Yisheng Company | -- |
| RT-qPCR | cDNA合成试剂盒 | Shanghai Yisheng Company | -- |
| Hieff UNICON qPCR SYBR Green预混液 | Shanghai Yisheng Company | -- | |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Omega | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Wuhan Pricella | -- | |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 显微成像 | 正交马赛克显微镜 | Zeiss | -- |
| 肝功能检测 | CD-1600CS生化分析仪 | Abbott Laboratories | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、性别、周龄、分组方式、CCl4剂量（15 μl/g）和注射频率（每周三次，持续6周）、PF562271剂量（14 mg/kg）和给药方式（口服，每日一次，持续4周）、对照组（玉米油或溶剂） 阅读提示：Materials and methods: Experimental protocol |
| 细胞培养 | LX-2细胞系来源、培养条件（DMEM高糖、10% FBS、1%双抗、5% CO2、37°C） 阅读提示：Materials and methods: The culture of cells |
| FAK抑制/过表达 | FAK抑制剂PF562271的浓度梯度、处理时间；慢病毒过表达FAK的滴度（5×10^8 TU/mL）和感染时间（72h）、嘌呤霉素筛选浓度（2-10 μg/mL） 阅读提示：Materials and methods: Lentivirus infection and Results section 3 |
| siRNA敲低 | siRNA序列（表1）、转染试剂（Lipofectamine 3000）用量、转染时间（6h）和检测时间（48h） 阅读提示：Materials and methods: siRNA transfection and Table 1 |
| 蛋白相互作用 | Co-IP所用抗体（FAK、TRIM25）、磁珠类型、洗涤条件；质谱分析流程；免疫荧光的固定、透化、封闭条件 阅读提示：Materials and methods: Immunoprecipitation, Immunofluorescence |
| 泛素化检测 | MG132使用浓度和时间、HA-Ub质粒转染、IP抗体（Myc） 阅读提示：Results section 5 and Figure S9 |
| 代谢检测 | 细胞上清收集时间（48h）、小鼠肝组织匀浆量（40mg）、裂解体积（500 μl PBS）、离心条件（4°C, 10,000g, 10min）、检测波长（530nm） 阅读提示：Materials and methods: Glucose and lactate assay |