生物信息学筛选差异表达基因和hub基因
从公共数据库(GEO、TCGA)中鉴定膀胱癌相关差异表达基因,并通过PPI网络筛选关键hub基因,以确定潜在治疗靶点。
从GEO数据库获取GSE130598数据集(32个样本)并进行差异基因分析;利用TCGA数据库(132个MIBC和2个正常样本)进行验证;构建PPI网络,筛选出10个hub基因(MTOR、CDK1、FYN等),并通过GEPIA、HPA等工具验证其表达。
Resveratrol inhibits bladder cancer proliferation by targeting the AURKA/STAT3 axis: From computational analysis to experimental validation.
研究包含生物信息学分析、分子对接、体外细胞实验(CCK8、流式、免疫荧光、qPCR、Western blot)等功能和机制验证,但缺乏体内动物实验和直接结合实验,实验完整度评为中等。
膀胱癌细胞系UMUC-3 正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1
细胞系来源及培养条件(UMUC-3和SV-HUC-1) 白藜芦醇处理浓度(0-1000 μM)和时间(2小时、24小时) MLN8237(AURKA抑制剂)处理浓度(0-150 μM)和时间(24小时) 分子对接结合位点及相互作用残基(Asp274、Gly145、Ala273等) qPCR和Western blot检测靶基因(AURKA、VEGF、Bcl-2、Cyclin D1)表达变化
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从公共数据库(GEO、TCGA)中鉴定膀胱癌相关差异表达基因,并通过PPI网络筛选关键hub基因,以确定潜在治疗靶点。
从GEO数据库获取GSE130598数据集(32个样本)并进行差异基因分析;利用TCGA数据库(132个MIBC和2个正常样本)进行验证;构建PPI网络,筛选出10个hub基因(MTOR、CDK1、FYN等),并通过GEPIA、HPA等工具验证其表达。
评估膀胱癌组织中免疫细胞浸润情况,并分析免疫细胞亚群与hub基因表达及患者生存的相关性。
使用CIBERSORT算法分析TCGA数据库中22种免疫细胞亚群的浸润比例;比较MIBC和正常组织间免疫浸润差异;进行生存分析以确定与预后相关的免疫细胞亚群。
预测白藜芦醇与AURKA蛋白的结合模式和亲和力,以支持其作为直接靶点的假设。
利用AutoDock软件进行分子对接:从PDB获取AURKA结构,从PubChem获取白藜芦醇结构;半柔性对接,选择能量最低的模型;使用Discovery Studio分析相互作用。
评估白藜芦醇对膀胱癌细胞(UMUC-3)的增殖抑制、周期阻滞和凋亡诱导作用,并确定IC30和IC50浓度。
使用CCK8法检测细胞存活率;计算白藜芦醇处理2h和24h的IC30和IC50;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。
评估AURKA抑制剂MLN8237对膀胱癌细胞的增殖抑制作用,并确定其IC50,以作为阳性对照。
使用CCK8法检测MLN8237处理UMUC-3细胞24小时后的存活率,计算IC50。
验证白藜芦醇和MLN8237是否通过抑制STAT3信号通路发挥作用,并检测下游靶基因的表达变化。
免疫荧光染色检测STAT3蛋白表达;qPCR检测AURKA和下游基因(VEGF、Bcl-2、Cyclin D1)的mRNA表达;Western blot检测相应蛋白的表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 白藜芦醇 | MCE | HY-16561 |
| MLN8237 | MCE | HY-10971 | |
| 药物溶解 | 二甲基亚砜 | Solarbio | -- |
| 细胞培养 | MEM完全培养基 | Keygen BIO | KGM41500S-500 |
| SV-HUC-1专用培养基 | Immocell | IM-H068-1 | |
| UMUC-3细胞系 | Procell | CL-0463 | |
| SV-HUC-1细胞系 | Immocell | IM-H068 | |
| RNA提取 | Trizon试剂 | Cwbio | CW0580S |
| mRNA提取 | mRNA超纯提取试剂盒 | Cwbio | CW0581M |
| miRNA提取 | miRNA提取试剂盒 | Cwbio | CW0627S |
| cDNA合成 | HiScript II Q RT SuperMix(qPCR专用,含gDNA去除) | Vazyme | R223-01 |
| 细胞活力检测 | CCK8试剂 | Keygen BIO | KGA317 |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒 | MULTI SCIENCES | AP101-100-kit |
| 细胞周期染色试剂盒 | MULTI SCIENCES | CCS102 | |
| 免疫荧光染色 | 4%组织细胞固定液 | Solarbio | P1110 |
| 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8020 | |
| 兔抗STAT3抗体 | HUABIOI | ET1605−45 | |
| Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L) | ABclonal | AS007 | |
| DAPI染色液 | Keygen BIO | KGA215−50 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Applygen | C1053 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Elabscience | E-BC-K318-M |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 专用脱脂奶粉 | Applygen | P1622 | |
| 小鼠抗GAPDH抗体 | TransGen Biotech | HC301 | |
| 小鼠抗AURKA抗体 | Proteintech | 66757-1-Ig | |
| 小鼠抗Bcl-2抗体 | ImmunoWay | YM3041 | |
| 兔抗VEGF抗体 | Affinity | AF5131 | |
| 兔抗cyclinD1抗体 | abcam | ab134175 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L) | Servicebio | GB23301 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Servicebio | GB23303 | |
| Western blot成像 | 高灵敏度化学发光成像系统 | Tanon | Tanon-5200 |
| 酶标仪 | 酶标仪 | -- | SuPer |
| 流式细胞仪 | 流式细胞仪 | Aisen Gene | NovoCyte |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Olympus | CKX53 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生物信息学分析 | 差异表达分析(GSE130598:16个MIBC和16个正常样本;TCGA:132个MIBC和2个正常样本),hub基因筛选(连接度≥24),阈值|log2FC|≥1且调整后P<0.05 阅读提示:2.1节、2.2节、2.3节和Fig2、Fig3 |
| 分子对接 | AURKA蛋白结构(PDB)经AlphaFold3修复,白藜芦醇结构(PubChem),对接盒子半径10,半柔性对接,10个构象,选择能量最低模型 阅读提示:2.6节和Fig6B |
| 细胞培养和处理 | 细胞系:UMUC-3(Procell,CL-0463)和SV-HUC-1(Immocell,IM-H068),培养基:MEM完全培养基(Keygen BIO,KGM41500S-500)和专用培养基(Immocell,IM-H068-1),培养条件:37°C、5% CO2,处理浓度和时间:白藜芦醇(0-1000 μM)处理2h或24h,MLN8237(0-150 μM)处理24h 阅读提示:2.6节、2.7节 |
| 细胞活力检测(CCK8) | 每孔100 μL细胞悬液,加入10 μL CCK8试剂,孵育2小时,检测450 nm吸光度,计算IC30和IC50 阅读提示:2.7节和Fig7 |
| 细胞凋亡和周期检测(流式) | 收集1x10^6细胞,PBS洗涤,凋亡检测:Annexin V-FITC和PI染色,周期检测:DNA染色液和透化液,室温避光孵育30分钟 阅读提示:2.7节和Fig8 |
| 免疫荧光染色 | 4%固定液固定15分钟,5% BSA封闭30分钟,STAT3抗体(1/200)4°C孵育过夜,Cy3标记二抗(1/200)37°C孵育30分钟,DAPI染色 阅读提示:2.8节和Fig9 |
| qPCR | RNA提取后cDNA合成(HiScript II Q RT SuperMix),PCR程序:95°C预变性30秒,95°C变性10秒,58°C退火30秒,72°C延伸30秒,40个循环,2-△△Ct法计算相对表达 阅读提示:2.6节、2.8节和Fig10A |
| Western blot | 蛋白提取(RIPA裂解液),BCA定量,SDS-PAGE电泳1.5小时,转膜300 mA 1-2小时,封闭后一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育2小时,化学发光成像 阅读提示:2.8节和Fig10B |