白藜芦醇通过靶向AURKA/STAT3轴抑制膀胱癌增殖:从计算分析到实验验证

Resveratrol inhibits bladder cancer proliferation by targeting the AURKA/STAT3 axis: From computational analysis to experimental validation.

作者信息Chao Feng, Guodong Chen, Yan Shu, Jing Chen, Wenxin Ye, Ligang Ren
PMID41616005
期刊PLoS One
发布时间2026-01-30
DOI10.1371/journal.pone.0342162

实验完整度

中

研究包含生物信息学分析、分子对接、体外细胞实验(CCK8、流式、免疫荧光、qPCR、Western blot)等功能和机制验证,但缺乏体内动物实验和直接结合实验,实验完整度评为中等。

主要模型

膀胱癌细胞系UMUC-3 正常膀胱上皮细胞系SV-HUC-1

重点核对

细胞系来源及培养条件(UMUC-3和SV-HUC-1) 白藜芦醇处理浓度(0-1000 μM)和时间(2小时、24小时) MLN8237(AURKA抑制剂)处理浓度(0-150 μM)和时间(24小时) 分子对接结合位点及相互作用残基(Asp274、Gly145、Ala273等) qPCR和Western blot检测靶基因(AURKA、VEGF、Bcl-2、Cyclin D1)表达变化

摘要

鉴于膀胱癌的高复发率以及常规治疗相关的显著不良反应,迫切需要寻找新的临床治疗靶点和更安全的天然来源化合物。白藜芦醇已被证明对各种肿瘤具有细胞毒性。然而,其抑制膀胱癌细胞的信号通路和靶点仍需进一步探索。本研究旨在通过抑制AURKA/STAT3轴来研究白藜芦醇在膀胱癌中的作用机制,为后续进一步研究白藜芦醇治疗膀胱癌提供重要的理论基础。通过生物信息学方法鉴定差异表达基因,并确定白藜芦醇的结合位点。采用CCK8法检测细胞存活率,计算白藜芦醇的30%抑制浓度和50%抑制浓度。然后,流式细胞术用于检测不同浓度白藜芦醇处理后的细胞周期和凋亡。免疫荧光染色用于检测白藜芦醇和MLN8237对STAT3表达的影响。Western blot和qPCR分析用于验证白藜芦醇和MLN8237对靶蛋白作用的可靠性。通过计算分析,AURKA被确定为白藜芦醇的潜在靶点。通过CCK8实验和流式细胞术的进一步验证表明,白藜芦醇能以时间和剂量依赖性方式抑制膀胱癌细胞及其细胞周期。免疫荧光染色显示,白藜芦醇和MLN8237均抑制膀胱癌细胞中STAT3的表达。此外,Western blot和qPCR分析证实,白藜芦醇和MLN8237抑制了AURKA及已知靶基因(VEGF、Bcl-2和Cyclin D1)的表达。我们的研究结果表明,白藜芦醇可能通过AURKA/STAT3轴调节膀胱癌细胞的表达,为白藜芦醇的结构优化和多靶点药物的临床开发提供理论基础。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
白藜芦醇抑制膀胱癌细胞增殖的作用机制是什么?其是否通过靶向AURKA并调控STAT3信号通路?
核心机制
白藜芦醇通过靶向AURKA并抑制AURKA/STAT3信号通路,下调STAT3及其下游靶基因(VEGF、Bcl-2、Cyclin D1)的表达,从而抑制膀胱癌细胞增殖和细胞周期进程。
主要证据
通过生物信息学分析(GEO和TCGA数据库)和分子对接预测AURKA为白藜芦醇的潜在靶点;体外实验(CCK8、流式细胞术)显示白藜芦醇以时间和剂量依赖性方式抑制UMUC-3细胞增殖并诱导凋亡;免疫荧光、qPCR和Western blot证实白藜芦醇和MLN8237抑制STAT3及其下游靶蛋白的表达。
研究意义
为白藜芦醇的结构优化和多靶点药物的临床开发提供理论基础,并提示AURKA/STAT3轴作为膀胱癌潜在治疗靶点的价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

生物信息学筛选差异表达基因和hub基因

从公共数据库(GEO、TCGA)中鉴定膀胱癌相关差异表达基因,并通过PPI网络筛选关键hub基因,以确定潜在治疗靶点。

从GEO数据库获取GSE130598数据集(32个样本)并进行差异基因分析;利用TCGA数据库(132个MIBC和2个正常样本)进行验证;构建PPI网络,筛选出10个hub基因(MTOR、CDK1、FYN等),并通过GEPIA、HPA等工具验证其表达。

2

免疫浸润分析

评估膀胱癌组织中免疫细胞浸润情况,并分析免疫细胞亚群与hub基因表达及患者生存的相关性。

使用CIBERSORT算法分析TCGA数据库中22种免疫细胞亚群的浸润比例;比较MIBC和正常组织间免疫浸润差异;进行生存分析以确定与预后相关的免疫细胞亚群。

3

分子对接预测白藜芦醇与AURKA的结合

预测白藜芦醇与AURKA蛋白的结合模式和亲和力,以支持其作为直接靶点的假设。

利用AutoDock软件进行分子对接:从PDB获取AURKA结构,从PubChem获取白藜芦醇结构;半柔性对接,选择能量最低的模型;使用Discovery Studio分析相互作用。

4

体外细胞实验验证白藜芦醇对膀胱癌细胞增殖的影响

评估白藜芦醇对膀胱癌细胞(UMUC-3)的增殖抑制、周期阻滞和凋亡诱导作用,并确定IC30和IC50浓度。

使用CCK8法检测细胞存活率;计算白藜芦醇处理2h和24h的IC30和IC50;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。

5

验证AURKA抑制剂MLN8237的作用

评估AURKA抑制剂MLN8237对膀胱癌细胞的增殖抑制作用,并确定其IC50,以作为阳性对照。

使用CCK8法检测MLN8237处理UMUC-3细胞24小时后的存活率,计算IC50。

6

验证白藜芦醇和MLN8237对STAT3通路的影响

验证白藜芦醇和MLN8237是否通过抑制STAT3信号通路发挥作用,并检测下游靶基因的表达变化。

免疫荧光染色检测STAT3蛋白表达;qPCR检测AURKA和下游基因(VEGF、Bcl-2、Cyclin D1)的mRNA表达;Western blot检测相应蛋白的表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
白藜芦醇MCEHY-16561
MLN8237MCEHY-10971
二甲基亚砜Solarbio--
MEM完全培养基Keygen BIOKGM41500S-500
SV-HUC-1专用培养基ImmocellIM-H068-1
UMUC-3细胞系ProcellCL-0463
SV-HUC-1细胞系ImmocellIM-H068
Trizon试剂CwbioCW0580S
mRNA超纯提取试剂盒CwbioCW0581M
miRNA提取试剂盒CwbioCW0627S
HiScript II Q RT SuperMix(qPCR专用,含gDNA去除)VazymeR223-01
CCK8试剂Keygen BIOKGA317
Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒MULTI SCIENCESAP101-100-kit
细胞周期染色试剂盒MULTI SCIENCESCCS102
4%组织细胞固定液SolarbioP1110
牛血清白蛋白SolarbioA8020
兔抗STAT3抗体HUABIOIET1605−45
Cy3标记山羊抗兔IgG(H+L)ABclonalAS007
DAPI染色液Keygen BIOKGA215−50
RIPA裂解液ApplygenC1053
BCA蛋白定量试剂盒ElabscienceE-BC-K318-M
PVDF膜MilliporeIPVH00010
专用脱脂奶粉ApplygenP1622
小鼠抗GAPDH抗体TransGen BiotechHC301
小鼠抗AURKA抗体Proteintech66757-1-Ig
小鼠抗Bcl-2抗体ImmunoWayYM3041
兔抗VEGF抗体AffinityAF5131
兔抗cyclinD1抗体abcamab134175
辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)ServicebioGB23301
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(H+L)ServicebioGB23303
高灵敏度化学发光成像系统TanonTanon-5200
酶标仪--SuPer
流式细胞仪Aisen GeneNovoCyte
荧光显微镜OlympusCKX53

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
生物信息学分析
差异表达分析(GSE130598:16个MIBC和16个正常样本;TCGA:132个MIBC和2个正常样本),hub基因筛选(连接度≥24),阈值|log2FC|≥1且调整后P<0.05
阅读提示:2.1节、2.2节、2.3节和Fig2、Fig3
分子对接
AURKA蛋白结构(PDB)经AlphaFold3修复,白藜芦醇结构(PubChem),对接盒子半径10,半柔性对接,10个构象,选择能量最低模型
阅读提示:2.6节和Fig6B
细胞培养和处理
细胞系:UMUC-3(Procell,CL-0463)和SV-HUC-1(Immocell,IM-H068),培养基:MEM完全培养基(Keygen BIO,KGM41500S-500)和专用培养基(Immocell,IM-H068-1),培养条件:37°C、5% CO2,处理浓度和时间:白藜芦醇(0-1000 μM)处理2h或24h,MLN8237(0-150 μM)处理24h
阅读提示:2.6节、2.7节
细胞活力检测(CCK8)
每孔100 μL细胞悬液,加入10 μL CCK8试剂,孵育2小时,检测450 nm吸光度,计算IC30和IC50
阅读提示:2.7节和Fig7
细胞凋亡和周期检测(流式)
收集1x10^6细胞,PBS洗涤,凋亡检测:Annexin V-FITC和PI染色,周期检测:DNA染色液和透化液,室温避光孵育30分钟
阅读提示:2.7节和Fig8
免疫荧光染色
4%固定液固定15分钟,5% BSA封闭30分钟,STAT3抗体(1/200)4°C孵育过夜,Cy3标记二抗(1/200)37°C孵育30分钟,DAPI染色
阅读提示:2.8节和Fig9
qPCR
RNA提取后cDNA合成(HiScript II Q RT SuperMix),PCR程序:95°C预变性30秒,95°C变性10秒,58°C退火30秒,72°C延伸30秒,40个循环,2-△△Ct法计算相对表达
阅读提示:2.6节、2.8节和Fig10A
Western blot
蛋白提取(RIPA裂解液),BCA定量,SDS-PAGE电泳1.5小时,转膜300 mA 1-2小时,封闭后一抗4°C孵育过夜,二抗室温孵育2小时,化学发光成像
阅读提示:2.8节和Fig10B