构建OA动物模型和细胞模型
建立体内外OA模型以研究USP7在OA进展中的作用。
使用DMM手术构建OA小鼠模型，使用IL-1β处理原代小鼠软骨细胞构建OA细胞模型。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
USP7调节TRPV1去泛素化介导软骨细胞铁死亡并缓解骨关节炎
USP7 Regulates TRPV1 Deubiquitination to Mediate Chondrocyte Ferroptosis and Alleviate Osteoarthritis.
实验完整度
高研究包含体外细胞模型（IL-1β处理软骨细胞）和体内动物模型（DMM诱导OA小鼠），并进行了功能验证（MTT、ROS、Fe2+、MDA）和机制验证（Co-IP、泛素化实验、CHX处理）。
主要模型
原代小鼠软骨细胞（IL-1β诱导的OA细胞模型） DMM诱导的OA小鼠模型
重点核对
IL-1β浓度（0、2.5、5、10 ng/mL）处理原代小鼠软骨细胞 小鼠分组（Sham、OA、OA+oe-USP7、OA+oe-USP7+sh-TRPV1），每组8只 腺病毒关节腔注射剂量（5 μL，1×10^9 pfu） Erastin浓度（10 μg/mL）处理 CHX浓度（100 μg/mL）及处理时间（0、2、4、8、16小时）
摘要
骨关节炎（OA）是一种常见的退行性关节疾病，以软骨细胞功能障碍为特征。在本研究中，我们探讨了泛素特异性蛋白酶7（USP7）在OA软骨细胞铁死亡中的功能与机制。通过免疫组化检测膝关节组织中USP7、TRPV1、II型胶原和GPX4的水平。番红O-固绿染色检测OA小鼠的组织病理学变化。RT-qPCR和蛋白质印迹法测定USP、TRPV1、II型胶原、iNOS、MMP13和MMP3的表达。原代小鼠软骨细胞在体外用IL-1β处理以模拟OA。软骨细胞活力通过MTT法评估。免疫荧光染色显示活性氧水平升高。MDA和Fe2+水平使用相应试剂盒测定。USP与TRPV1的相互作用通过免疫共沉淀检测。免疫沉淀法评估TRPV1的泛素化水平。在OA小鼠和IL-1β刺激的软骨细胞中USP7表达下调。USP7过表达抑制IL-1β刺激的软骨细胞铁死亡和细胞外基质（ECM）降解。USP7作为TRPV1的去泛素化酶，增强了TRPV1的稳定性。增强的TRPV1抑制了IL-1β触发的软骨细胞铁死亡和ECM降解。沉默TRPV1逆转了USP7上调对IL-1β诱导的软骨细胞铁死亡及OA小鼠OA的影响。因此，USP7通过去泛素化并上调TRPV1保护软骨细胞免受铁死亡并改善OA进展，从而为OA治疗提供了新的靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- USP7在骨关节炎软骨细胞铁死亡中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- USP7通过去泛素化稳定TRPV1，上调TRPV1表达，进而通过促进GPX4表达抑制软骨细胞铁死亡和ECM降解。
- 主要证据
- 在IL-1β刺激的软骨细胞和DMM诱导的OA小鼠模型中，USP7过表达抑制铁死亡和ECM降解；Co-IP和泛素化实验证明USP7与TRPV1相互作用并去泛素化；CHX实验证明USP7增强TRPV1蛋白稳定性；TRPV1敲低或Erastin处理逆转了USP7过表达的保护作用。
- 研究意义
- USP7可作为OA治疗的潜在靶点，为OA的精准个性化治疗提供分子基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测USP7表达
验证USP7在OA小鼠和IL-1β刺激的软骨细胞中的表达水平。
通过免疫组化、Western blot和RT-qPCR检测USP7的表达。
评估USP7过表达对软骨细胞铁死亡和ECM降解的影响
确定USP7过表达是否抑制IL-1β诱导的软骨细胞铁死亡和ECM降解。
用oe-USP7或oe-NC转染软骨细胞，检测细胞活力、ROS水平、Fe2+、MDA以及相关蛋白表达。
验证USP7对TRPV1的去泛素化作用
确认USP7是否作为去泛素化酶调节TRPV1的泛素化和稳定性。
通过泛素化实验、Co-IP和CHX处理，检测USP7与TRPV1的相互作用及对TRPV1泛素化水平和蛋白稳定性的影响。
验证TRPV1过表达对软骨细胞铁死亡的影响
确定TRPV1过表达是否抑制IL-1β诱导的软骨细胞铁死亡和ECM降解。
用oe-TRPV1或oe-NC转染软骨细胞，检测细胞活力、ROS、Fe2+、MDA以及相关蛋白表达。
验证TRPV1敲低或铁死亡诱导剂对USP7过表达效应的逆转作用
证实TRPV1在USP7介导的抗铁死亡效应中的必要性。
在IL-1β和Erastin处理下，同时转染oe-USP7和sh-TRPV1或对照，检测细胞活力、ROS、Fe2+、MDA及相关蛋白表达。
体内验证USP7/TRPV1轴对OA小鼠的影响
在体内验证USP7通过TRPV1缓解OA的效应。
对DMM模型小鼠进行oe-USP7和sh-TRPV1处理，通过番红O-固绿染色、免疫组化和Western blot分析组织学及蛋白表达变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | Ad-oe-USP7 | GenePharma | -- |
| Ad-sh-TRPV1 | GenePharma | -- | |
| 免疫组化 | USP7抗体 | Invitrogen | PA5-34911 |
| II型胶原抗体 | Invitrogen | PA5-99159 | |
| TRPV1抗体 | Invitrogen | 75-254 | |
| GPX4抗体 | Invitrogen | MA5-32827 | |
| 显微镜 | Olympus | -- | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| USP7抗体 | Invitrogen | PA5-34911 | |
| TRPV1抗体 | Invitrogen | 75-254 | |
| II型胶原抗体 | Invitrogen | PA5-99159 | |
| iNOS抗体 | Invitrogen | PA1-036 | |
| MMP13抗体 | Invitrogen | MA5-14238 | |
| MMP3抗体 | Invitrogen | MA5-42477 | |
| GPX4抗体 | Invitrogen | MA5-32827 | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 化学发光试剂 | Beyotime | -- | |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Beyotime | -- |
| Prime Script RT反转录试剂盒 | Takara | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Solarbio | -- | |
| ABI 7500 Fast实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分离与培养 | DMEM/F12培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 重组小鼠IL-1β | Peprotech | -- | |
| 细胞处理 | 伊拉斯汀 | Selleck Chemicals | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| MTT assay | MTT试剂 | Promega | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | MedChemExpress | -- |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| Fe2+检测 | 铁检测试剂盒 | Abcam | -- |
| MDA检测 | 脂质过氧化MDA检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 泛素化检测 | Protein A/G Plus-琼脂糖免疫沉淀试剂 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 抗HA抗体 | Abcam | ab9110 | |
| 免疫共沉淀 | 抗Flag抗体 | Invitrogen | MA1-142 |
| 抗USP7抗体 | Invitrogen | PA5-34911 | |
| IgG抗体 | Sigma | R5130 | |
| Protein A+G琼脂糖珠 | Beyotime | -- | |
| 组织染色 | 番红O/固绿 | Sigma | -- |
| 统计分析 | SPSS软件 | IBM | version |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系、周龄、性别、体重、分组、每组样本量、手术方式、麻醉剂量、腺病毒注射剂量和时间 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Construction of OA Animal Model |
| 细胞模型构建 | 细胞来源、小鼠年龄、软骨消化条件、培养基、IL-1β浓度和处理时间 阅读提示：Materials and Methods 2.5 Mouse Chondrocyte Isolation and Culture |
| 细胞转染 | 转染试剂、质粒载体、shRNA序列、转染时间 阅读提示：Materials and Methods 2.6 Cell Transfection |
| 铁死亡指标检测 | 细胞活力检测方法、ROS探针浓度和孵育时间、Fe2+和MDA检测试剂盒及操作步骤 阅读提示：Materials and Methods 2.7, 2.8, 2.9, 2.10 |
| 蛋白互作与泛素化检测 | 裂解液、抗体、琼脂糖珠、孵育时间、洗涤次数、检测抗体 阅读提示：Materials and Methods 2.11, 2.12 |