皮下移植瘤模型构建与药物筛选
筛选对CRC有效的候选小分子化合物。
使用HT29、HCT116、SW620细胞系建立BALB/c-nu小鼠皮下移植瘤模型，分别用(+)-Gallocatechin、Ziyuglycoside I和Calycosin处理，比较肿瘤体积和重量。
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Calycosin靶向CYP1B1-AKT/SP1-GPX4轴调节结直肠癌发生中的铁死亡
Calycosin Targets the CYP1B1-AKT/SP1-GPX4 Axis to Modulate Ferroptosis in Colorectal Carcinogenesis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（迁移、侵袭、凋亡、铁死亡相关蛋白检测）、转录组测序、CETSA、定点突变、分子对接、体内皮下移植瘤模型及CYP1B1敲低/过表达功能验证，证据层级完整。
主要模型
人结直肠癌细胞系HT29、HCT116、SW620 HEK-293细胞 BALB/c-nu小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
Calycosin体外处理浓度100 μM，处理时间24 h Calycosin体内给药剂量5 mg/kg，腹腔注射 CYP1B1敲低和过表达细胞系的构建及验证 CETSA和定点突变确认CYP1B1 Gly-329为结合位点 SP1与GPX4启动子结合位点及双荧光素酶报告基因验证
摘要
Calycosin是一种来源于中药的天然黄酮类小分子化合物，在癌症治疗领域已显示出显著的药理活性。本研究通过体内外综合实验，系统阐明了Calycosin治疗结直肠癌（CRC）的分子机制。体内实验显示，Calycosin能有效抑制CRC荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长。体外实验和转录组测序证实，Calycosin能有效抑制人CRC细胞的迁移、侵袭、上皮-间质转化（EMT），并诱导铁死亡，从而抑制恶性肿瘤行为。细胞热位移分析（CETSA）和定点突变实验首次确定了细胞色素P450 1B1（CYP1B1）和Gly-329是Calycosin的关键结合靶点和位点。功能研究表明，体外和体内CYP1B1敲低可抑制GPX4表达并增强CRC细胞的铁死亡。机制上，CYP1B1激活AKT/SP-1信号通路上调GPX4表达，从而调节结直肠癌的发生和进展。总之，本研究首次揭示了Calycosin和CYP1B1-AKT/SP1-GPX4调控轴在CRC铁死亡中的关键作用，为中药来源小分子靶向治疗结直肠癌提供了新的理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Calycosin如何通过靶向CYP1B1调控结直肠癌细胞的铁死亡及其分子机制。
- 核心机制
- Calycosin结合CYP1B1，抑制AKT激活，减少SP1与GPX4启动子的结合，下调GPX4表达，同时上调ACSL4，从而诱导铁死亡。
- 主要证据
- 体外实验显示Calycosin抑制CRC细胞迁移、侵袭、EMT并诱导铁死亡（划痕、Transwell、流式细胞术、Western blot）；体内实验显示Calycosin抑制皮下肿瘤生长，且CYP1B1敲低后Calycosin的抑制效果消失；CETSA和定点突变证实CYP1B1 Gly-329为关键结合位点；双荧光素酶实验证实SP1结合GPX4启动子关键区域。
- 研究意义
- 首次揭示Calycosin和CYP1B1-AKT/SP1-GPX4轴在CRC铁死亡中的作用，为中药小分子靶向治疗结直肠癌提供新理论基础，并为联合治疗提供探索方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验
评估Calycosin对CRC细胞迁移、侵袭、EMT和凋亡的影响。
使用划痕实验、Transwell实验、流式细胞术和Western blot检测Calycosin处理的CRC细胞（HT29、HCT116、SW620），并检测EMT相关蛋白和凋亡率。
转录组测序和铁死亡分析
全局分析Calycosin对CRC细胞基因表达的影响，并聚焦细胞死亡相关通路。
对SW620细胞进行转录组测序，分析差异表达基因，并结合GSEA数据库筛选凋亡、坏死和铁死亡相关基因，验证铁死亡相关蛋白表达。
靶点预测与验证
识别Calycosin的直接结合靶点和结合位点。
使用数据库和分子对接预测靶点，通过CETSA和定点突变验证CYP1B1及其Gly-329位点。
CYP1B1功能验证
验证CYP1B1在CRC细胞功能及铁死亡中的作用。
构建CYP1B1敲低和过表达稳定细胞系，检测迁移、侵袭、凋亡及铁死亡相关蛋白表达。
体内CYP1B1敲低及Calycosin联合实验
验证CYP1B1是Calycosin发挥体内抗肿瘤作用的关键靶点。
使用CYP1B1敲低HT29和SW620细胞建立皮下移植瘤模型，并用Calycosin处理，比较肿瘤生长及GPX4/ACSL4表达。
机制解析
阐明CYP1B1调控GPX4表达的具体信号通路。
通过Western blot检测AKT、ERK、SP1磷酸化，使用AKT抑制剂MK-2206验证，并通过双荧光素酶实验确认SP1结合GPX4启动子区。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | #C11995500BT |
| MEM培养基 | Pricella | #PM150467 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | 毛蕊异黄酮 | MCE | #HY-N0519 |
| (+)-没食子儿茶素 | MCE | HY-N0521A | |
| 地榆皂苷I | MCE | #HY-N0331 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| MK-2206 2HCl | Selleck | S1078 | |
| 二甲基亚砜 | MCE | #HY-Y0320 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | #P0013C |
| PVDF膜 | Millipore | #IPVH00010 | |
| 脱脂奶粉 | Sangon Biotech | #A600669 | |
| ECL发光液 | Millipore | #WBKLS0100 | |
| 抗CYP1B1抗体 | ABclonal | #A1377 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | CST | #4065 | |
| 抗N-钙黏蛋白抗体 | CST | #4061 | |
| 抗波形蛋白抗体 | Abclonal | #A19607 | |
| 抗FTH1抗体 | CST | #3998 | |
| 抗GPX4抗体 | ABclonal | #A11243 | |
| 抗ACSL4抗体 | ABclonal | #A20414 | |
| 抗NOX1抗体 | ABclonal | #A8527 | |
| 抗磷酸化SP1-T739抗体 | ABclonal | #AP0231 | |
| 抗磷酸化NF-kB p65/RelA-S536抗体 | ABclonal | #AP1294 | |
| 抗磷酸化c-Jun-S63抗体 | ABclonal | #AP0105 | |
| 抗TFAP2A抗体 | ABclonal | #A2294 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | ABclonal | #AP0234 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | #AC026 | |
| 抗组蛋白抗体 | ABclonal | #A2348 | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | Invitrogen | #31466 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | PTG | #SA00001-1 | |
| 免疫组织化学 | 柠檬酸盐缓冲液 | Thermo Fisher | #005000 |
| 免疫荧光 | EDTA抗原修复液 | Servicebio | #G1207 |
| 牛血清白蛋白 | Servicebio | #GC305010 | |
| DAPI | Servicebio | #G1012 | |
| 自发荧光淬灭剂 | Servicebio | #G1221 | |
| 抗CYP1B1抗体 | ABclonal | #A1377 | |
| 流式细胞术 | Annexin V/PI试剂盒 | Key GEN | #KGA107 |
| Transwell实验 | 基质胶 | Corning | #356234 |
| 结晶紫 | Sigma-Aldrich | #32675 | |
| 转录组测序 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | #15596018 |
| Dynabeads Oligo (dT)磁珠 | Thermo Fisher | #25-61005 | |
| NEBNext镁离子RNA片段化模块 | NEB | E6150S | |
| SuperScript II逆转录酶 | Invitrogen | #1896649 | |
| DNA聚合酶I | NEB | #m0209 | |
| RNase H | NEB | #m0297 | |
| dUTP溶液 | Thermo Fisher | #R0133 | |
| UDG酶 | NEB | m0280 | |
| Illumina Novaseq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 质粒构建 | PCDNA3.1-MCS-EF1-ZsGreen质粒 | Genomeditech | #GM-8630P1 |
| E. coli stbl3菌株 | Thermo Fisher | #G1036 | |
| 慢病毒感染 | pHBLV-CMV-MCS-EF1-ZsGreen质粒 | Hanheng Biology | -- |
| pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen质粒 | Hanheng Biology | -- | |
| 双荧光素酶报告实验 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Hanbio | HB-DLR-100 |
| 动物实验 | 异氟烷 | RWD | #R510-22-10 |
| 全自动生化分析仪BS-240 | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co. Ltd. | BS-240 | |
| 细胞热位移分析 | PCR仪 VeritiPro | Thermo Fisher Scientific | VeritiPro |
| 双荧光素酶报告实验 | 多功能酶标仪 SuPerMax3100 | Shanghai Shanpu Biotechnology Co. Ltd. | SuPerMax3100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 药物处理 | Calycosin体外工作浓度100 μM，体内剂量5 mg/kg；Ferrostatin-1浓度10 μM；MK-2206浓度HT29 66 μM、SW620 200 μM 阅读提示：见Methods 2.1 Main Chemicals and Reagents |
| 细胞培养 | HT29、HCT116、SW620使用高糖DMEM+10%FBS+100 U/mL P/S；HEK-293使用MEM+10%FBS；培养条件37°C、5% CO2 阅读提示：见Methods 2.2 Cell Line |
| 动物模型 | BALB/c-nu小鼠，6-8周龄，18-20 g；细胞接种量1×10^6或2×10^6；给药方式腹腔注射；模型周期27天 阅读提示：见Methods 2.3 Construction of Subcutaneous Animal Models |
| 转录组测序 | SW620细胞，Calycosin 100 μM处理24 h；RNA质量要求浓度>50 ng/μL、RIN>7.0、总量>1 μg；测序平台Illumina Novaseq 6000 PE150 阅读提示：见Methods 2.6 Transcriptome Sequencing and Analysis |
| CETSA | HT29和SW620细胞处理24 h；温度梯度35、40、45、50、55、60、65、70°C；加热3 min；液氮冻融3次；离心12000 rpm 20 min 阅读提示：见Methods 2.12 Cellular Thermal Shift Assay (CETSA) |
| 双荧光素酶报告实验 | GPX4启动子片段（Full、Mut1、Mut2、Mut3）和SP1过表达质粒共转染HEK-293T细胞；48 h后检测荧光素酶活性；实验重复三次 阅读提示：见Methods 2.15 Promoter Transfection and Luciferase Assay |