患者转录组分析
鉴定AU患者PBMCs中与炎症和氧化应激相关的差异表达基因。
对6例VKH患者和6例健康对照的PBMCs进行RNA-seq，通过GO分析和差异表达基因检测APOE等基因的表达变化。
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载脂蛋白E通过上调肽基脯氨酰异构酶F驱动自身免疫性葡萄膜炎中的小胶质细胞活化
Apolipoprotein E drives microglia activation in the development of autoimmune uveitis through up-regulation of peptidyl prolyl isomerase F.
实验完整度
高包含患者转录组、单细胞RNA测序、基因敲除小鼠、细胞功能实验、蛋白质组学和体内过表达等多个独立证据层级，且明确包含功能验证和机制验证。
主要模型
VKH患者PBMCs EAU小鼠模型 HMC3人小胶质细胞系
重点核对
患者样本：6例VKH患者与6例年龄匹配的健康对照PBMCs RNA-seq 小鼠模型：C57BL/6NCrl小鼠和APOE−/−小鼠，EAU诱导使用IRBP651–670肽500μg皮下注射和1μg百日咳毒素腹腔注射 细胞模型：HMC3细胞，IL-17a和IFN-γ刺激浓度梯度 基因操作：sh-APOE慢病毒和PPIF过表达慢病毒转导，腺病毒或AAV玻璃体腔注射
摘要
自身免疫性葡萄膜炎（AU）是一类具有不同病理原因的致盲性疾病。对AU患者的转录组分析显示，其外周血单个核细胞（PBMCs）中存在高度氧化应激谱以及载脂蛋白E（APOE）表达上调。此外，实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）小鼠模型中视网膜小胶质细胞的单细胞RNA测序也鉴定出APOE表达上调。我们和他人的结果先前表明，小胶质细胞与AU的发生密切相关。同时，尽管APOE已被报道具有从脂质代谢到神经再生的多种功能，但对其在AU发生中的具体机制知之甚少。在本研究中，使用小鼠EAU模型来研究APOE、小胶质细胞和EAU之间的关联，结果发现APOE对于EAU的诱导是不可或缺的，因为APOE−/−小鼠未能发展出EAU。使用小胶质细胞的体外研究进一步表明，APOE与小胶质细胞炎症正相关，这可以通过使用短发夹RNA敲低APOE来逆转。蛋白质组学分析表明，APOE介导的小胶质细胞活化依赖于活性氧（ROS）通路，通过肽基脯氨酰异构酶F（PPIF）实现，这一点在来自AU患者的PBMCs中得到了进一步验证。补充PPIF可逆转体外APOE缺乏引起的ROS活化。此外，腺相关病毒介导的PPIF过表达加剧了EAU表型，表明其在驱动葡萄膜炎发生中的重要作用。这些结果为理解APOE和PPIF在葡萄膜炎发病机制中的作用提供了认识。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- APOE是否通过PPIF调控小胶质细胞活化，从而影响自身免疫性葡萄膜炎的发生发展？
- 核心机制
- APOE通过上调PPIF表达，进而通过ROS通路驱动小胶质细胞活化，促进葡萄膜炎的发展。
- 主要证据
- 患者PBMCs转录组和EAU小鼠视网膜单细胞RNA-seq显示APOE上调；APOE敲除小鼠EAU诱导失败；HMC3细胞中APOE敲低降低炎症，PPIF补充逆转APOE敲低引起的ROS损伤；PPIF过表达加剧EAU。
- 研究意义
- 本研究阐明了APOE和PPIF在葡萄膜炎发病机制中的作用，为葡萄膜炎提供了潜在的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EAU模型单细胞RNA测序
分析EAU小鼠视网膜小胶质细胞的转录组变化，鉴定APOE的表达情况。
对EAU和naïve小鼠视网膜CD45+细胞进行FACS分选和单细胞RNA-seq，比较小胶质细胞中APOE等基因表达。
EAU模型病理验证
验证EAU小鼠视网膜中APOE表达与小胶质细胞活化和炎症的关系。
通过裂隙灯检查和HE染色评估EAU临床和组织病理学评分，通过Western blot检测APOE、iNOS、TNF-α、IL-6表达，通过免疫荧光检测IBA1和APOE共定位。
APOE敲除和敲低对EAU的影响
评估APOE缺失或敲低对EAU发展和小胶质细胞炎症的影响。
使用APOE−/−小鼠和AAV介导的APOE shRNA敲低，评估EAU严重程度和炎症指标。
HMC3细胞炎症模型
研究APOE表达与小胶质细胞炎症表型的关系。
用不同浓度的IL-17a和IFN-γ刺激HMC3细胞，检测APOE、iNOS、TNF-α、IL-6表达以及细胞迁移和增殖。
APOE敲低对细胞功能的影响
验证APOE敲低是否抑制小胶质细胞炎症、迁移和增殖。
用sh-APOE慢病毒转导HMC3细胞，然后进行细胞因子刺激，检测炎症蛋白表达、迁移和增殖。
蛋白质组学分析
鉴定APOE介导的小胶质细胞活化的下游通路和关键蛋白。
对sham、刺激、sh-APOE的HMC3细胞进行蛋白质组学分析，通过KEGG通路分析发现ROS通路和PPIF。
PPIF功能验证
验证PPIF是APOE的下游效应分子，并评估其功能。
在APOE敲低的HMC3细胞中过表达PPIF，检测ROS、炎症指标和线粒体功能；在EAU小鼠中通过玻璃体腔注射腺病毒过表达PPIF，评估对EAU的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA提取和建库 | TRNzol通用试剂盒 | TIANGEN Biotech | DP424 |
| RNA文库构建 | VAHTS Universal V8 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | -- |
| DNA定量 | 高灵敏度DNA检测试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA完整性检测 | 安捷伦生物分析仪2100 | Agilent | -- |
| 测序 | MGISEQ-T7测序仪 | MGI | -- |
| EAU诱导 | IRBP651–670肽 | Sangon | -- |
| 完全弗氏佐剂 | Sigma-Aldrich | F5881 | |
| 百日咳毒素 | Sigma-Aldrich | P7208 | |
| 裂隙灯检查 | 0.5%盐酸丙美卡因 | -- | -- |
| 细胞培养 | 最低必需培养基 | BasalMedia | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 组织固定 | 眼球固定液 | Servicebio | G1109 |
| EdU实验 | EdU细胞增殖试剂盒 | Beyotime | C0071S |
| 迁移实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 1%结晶紫 | Servicebio | G1014 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 抗iNOS抗体 | Cell Signaling Technology | 2982 | |
| APOE抗体 | Cell Signaling Technology | 49285 | |
| IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| IL-6抗体 | Cell Signaling Technology | 12912T | |
| TNF-α抗体 | Proteintech | 26405-1-AP | |
| PPIF抗体 | Proteintech | 18466-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗β-actin抗体 | Proteintech | 81115-1-RR | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L) | Proteintech | SA00001-2 | |
| ECL化学发光试剂盒 | Advansta | -- | |
| 免疫荧光 | 抗APOE抗体 | Servicebio | GB112288 |
| 抗IBA1抗体 | Wako | 019-19741-20 | |
| DAPI封片剂 | Abcam | AB104139 | |
| ROS检测 | CellROX探针 | Thermo Fisher Scientific | C10422 |
| NucBlue活细胞染色ReadyProbes试剂 | Thermo Fisher Scientific | R37605 | |
| OCR测量 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- |
| Seahorse XFe 24细胞外流量分析仪 | Agilent | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 木瓜蛋白酶解离系统 | Worthington | WK-LK003150 |
| 小鼠Fc受体阻断剂 | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| 流式固定/透化缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-5223-56, | |
| 流式透化缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | 00-8333-56 | |
| 抗CD45 APC/Cyanine7抗体 | BioLegend | 157204 | |
| 抗CD11b Horizon RB705抗体 | BD | 570292 | |
| 抗CX3CR1 Pacific Blue抗体 | BioLegend | 149038 | |
| 抗TNF-α Percp/Cyanine5.5抗体 | BioLegend | 506322 | |
| 抗IL-6 APC抗体 | BioLegend | 504508 | |
| 抗iNOS PE抗体 | BioLegend | 696806 | |
| 蛋白质组学 | EASY-nLC 1200纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Orbitrap Exploris 480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者样本收集与RNA-seq | VKH诊断标准；PBMC分离流程；RNA提取试剂盒和建库试剂盒；测序平台 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Patient diagnosis and specimen processing”和“Whole-blood specimen RNA-seq” |
| EAU诱导 | 小鼠品系和年龄（C57BL/6NCrl，6-8周）；IRBP651–670肽剂量（500μg）、佐剂和注射方式；百日咳毒素剂量（1μg）和注射方式；EAU评分标准和评估时间点（14天） 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Animals”和“EAU induction” |
| HMC3细胞培养与刺激 | 细胞来源（Procell）；培养基（MEM+10%FBS+1%PS）；IL-17a和IFN-γ刺激浓度和持续时间 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Cell lines and cell culture”和Results部分图3 |
| APOE敲低和PPIF过表达 | 慢病毒载体（pMagic7.1-Puro/GFP, pLVX-CMV-3FLAG-PPIF-CAG-mCherry-T2A-neomycin-WPRE）；shRNA序列；转导MOI或病毒量；转导后筛选条件（嘌呤霉素和/或新霉素） 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Lentivirus transduction” |
| 蛋白质组学 | 细胞样品分组（sham、刺激、sh-APOE）；蛋白质提取和酶解方法；LC-MS/MS参数；DIA-NN版本 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Proteomic analysis” |
| 体内PPIF过表达 | 腺病毒载体（pAD-CAG-3FLAG-PPIF-P2A-mCherry-WPRE）和血清型；玻璃体腔注射体积和病毒滴度；注射后EAU诱导的时间间隔（2周） 阅读提示：参见Materials and Methods中的“Adenovirus intravitreal injection” |