建立OIS细胞模型
建立癌基因诱导衰老模型，用于研究O-GlcNAc修饰在衰老中的作用。
使用hTERT永生化的人原代肺成纤维细胞，通过慢病毒转导doxycycline诱导的RASG12V表达系统（LU-RAS），进行OIS诱导，并通过SA-β-Gal染色和细胞周期分析验证衰老表型。
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时间分辨多组学分析揭示染色质O-GlcNAc修饰促进衰老相关转录程序
Time-resolved multiomics profiling reveals chromatin O-GlcNAc modification promotes senescence-associated transcriptional program.
实验完整度
高包含体外细胞模型、动物移植瘤模型、多组学分析及分子动力学模拟等多层级验证，涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
LU1015人原代肺成纤维细胞（LU-RAS） SK0304人原代皮肤成纤维细胞（SK-RAS） A549肺癌细胞 裸鼠异种移植模型
重点核对
OIS诱导时间点D0、D2、D4、D6、D8、D10 OGT和OGA表达水平变化 JUN S84A和GATAD2A S182A突变对复合物组装的影响 OSMI-4（5 μM）抑制O-GlcNAc修饰 裸鼠共注射模型中A549与LU-RAS细胞的比例（2.5×10^6:5×10^6）
摘要
O-GlcNAc修饰是一种关键的细胞信号，但其在调控衰老相关转录中的作用仍知之甚少。在此，我们应用一种时间分辨的化学基因组学策略，在原发性人成纤维细胞发生癌基因诱导衰老（OIS）过程中，绘制动态的O-GlcNAc染色质相关蛋白（OCPs）图谱。染色质O-GlcNAc修饰持续积累，而1，987个衰老相关的OCPs在基因组上的占据在不同表观遗传染色质状态下发生动态变化，并在3，466个基因的衰老转录组中表现出双峰调控活性。O-GlcNAc促进双功能复合物的形成：TF-SWI/SNF在启动子处激活衰老相关分泌表型（SASP）基因，而NuRD在增强子处强制抑制细胞周期调控因子。此外，我们确定O-GlcNAc修饰的JUN和GATAD2A是衰老驱动的肿瘤发生过程中体外和体内模型OIS表型的关键调控因子。这些发现揭示了O-GlcNAc相关表观遗传因子的动态调控和染色质组织原理，为细胞衰老和潜在治疗策略提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- O-GlcNAc修饰如何调控癌基因诱导衰老过程中的基因表达？
- 核心机制
- O-GlcNAc修饰促进TF-SWI/SNF复合物在启动子处激活SASP基因，并促进NuRD复合物在增强子处抑制细胞周期基因，从而双向调控衰老转录组。
- 主要证据
- 通过COGC-seq、ChIP-seq和RNA-seq等多组学分析，发现O-GlcNAc修饰的JUN和GATAD2A增强染色质结合，分别激活SASP基因和抑制细胞周期基因；突变体（S84A和S182A）改变这些效应。
- 研究意义
- 揭示了O-GlcNAc修饰在衰老中的新表观遗传功能，为靶向O-GlcNAc修饰的JUN和GATAD2A以调控衰老相关肿瘤发展提供了治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测O-GlcNAc修饰的动态变化
分析OIS过程中O-GlcNAc修饰水平的变化及对衰老进程的影响。
通过免疫印迹检测全细胞裂解物和染色质结合蛋白中的O-GlcNAc水平，并使用OGT/OGA抑制剂（OSMI-4、TMG）及敲低/过表达OGT来调节O-GlcNAc水平，观察SA-β-Gal活性和增殖能力的变化。
多组学分析OCPs动态变化
系统绘制OIS过程中OCPs的蛋白质组和染色质占据动态，并关联转录组变化。
利用1，6-Pr2GalNAz代谢标记和点击化学，结合定量蛋白质组学（LC-MS/MS）和COGC-seq，分析OCPs的变化；同时进行RNA-seq和ChIP-seq分析组蛋白修饰，使用ChromHMM分析染色质状态转换。
鉴定OCPs形成表观遗传复合物
验证OCPs是否组装为NuRD和SWI/SNF复合物，并受O-GlcNAc调控。
通过蛋白质互作网络分析（STRING）预测复合物，使用免疫共沉淀（co-IP）和sWGA凝集素拉下实验检测O-GlcNAc修饰和复合物组分，并用OSMI-4处理观察复合物解离。
定位O-GlcNAc位点并验证功能
确定JUN和GATAD2A上的O-GlcNAc位点，并验证其对复合物组装和染色质结合的重要性。
通过质谱分析鉴定O-GlcNAc位点，构建S182A和S84A突变体，通过co-IP、sWGA拉下、凝胶过滤和免疫荧光实验分析突变对复合物组装和核共定位的影响；分子动力学模拟研究O-GlcNAc增强蛋白互作的机制。
验证O-GlcNAc修饰对染色质占据和基因表达的影响
测试O-GlcNAc修饰的JUN和GATAD2A是否影响其靶基因的染色质结合和表达。
对表达野生型或突变型JUN和GATAD2A的细胞进行ChIP-seq、ChIP-qPCR和RNA-seq，比较突变对染色质结合和基因表达的影响，并用OSMI-4处理验证药理学抑制效果。
评估O-GlcNAc修饰在体外对衰老表型和肿瘤进展的影响
评估O-GlcNAc缺失的JUN和GATAD2A对细胞衰老表型和SASP介导的肿瘤细胞行为的影响。
比较LU-RAS/KD-WT和LU-RAS/KD-AA细胞的SA-β-Gal活性、细胞周期和增殖；使用Transwell共培养系统，检测SASP因子对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
验证O-GlcNAc修饰在体内对肿瘤生长的影响
在体内验证O-GlcNAc修饰的JUN和GATAD2A对衰老相关肿瘤生长的作用。
将A549-GFP细胞与LU-RAS或其衍生细胞（WT或AA）皮下共注射到裸鼠中，监测肿瘤生长，并通过IHC和免疫印迹分析衰老和增殖标志物的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | PriGrow VII培养基 | abm | TM017 |
| PriGrow III培养基 | abm | TM003 | |
| 完全培养基 | Procell | CM-0525 | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素溶液 | Gibco | -- | |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052 | |
| 支原体检测试剂盒 | InvivoGen | -- | |
| 药物处理 | OSMI-4 | Selleck | S8910 |
| Thiamet-G | Selleck | S7213 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 基因操作 | hTERT慢病毒 | Applied Biological Materials Inc. | -- |
| pLVX-Tet3G载体 | Addgene | 28061 | |
| pLKO.1-Hygro载体 | Addgene | 24150 | |
| OGT shRNA质粒 | Santa Cruz | sc-40780-V | |
| 乱序shRNA质粒 | Addgene | 1864 | |
| pLenti-CMV-MCS-blank骨架载体 | Addgene | 17448 | |
| 蛋白质分析 | Western/IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| SDS裂解液 | Beyotime | P0013G | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | Millipore-Sigma | -- | |
| 抗体验证 | 抗O-GlcNAc抗体（CTD110.6） | CST | 9875 |
| 抗JUN抗体 | Abcam | ab40766 | |
| 抗GATAD2A抗体 | CST | 17705 | |
| 抗OGT抗体 | Abcam | ab96718 | |
| 抗OGA抗体 | CST | 60406 | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| 抗Flag抗体 | CST | 14793 | |
| 抗HA抗体 | CST | 3724 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | CST | 4499 | |
| 抗MBD2抗体 | Abcam | ab188474 | |
| 抗MTA1抗体 | Proteintech | 30545-1-AP | |
| 抗CHD4抗体 | Proteintech | 14173-1-AP | |
| 抗SMCA4抗体 | Proteintech | 21634-1-AP | |
| 抗SMRC1抗体 | Proteintech | 17722-1-AP | |
| 抗SNF5抗体 | Abcam | ab307985 | |
| 抗p53抗体 | Proteintech | 10442-1-AP | |
| 抗p21WAF1/Cip1抗体 | Proteintech | 10355-1-AP | |
| 抗p16INK4A抗体 | Proteintech | 10883-1-AP | |
| 抗LMNB1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| 抗MKI67抗体 | Proteintech | 84192-4-RR | |
| 抗SP1抗体 | Proteintech | 21962-1-AP | |
| 抗SRSF2抗体 | Proteintech | 20371-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| 抗TERT抗体 | Proteintech | 27586-1-AP | |
| 抗FOXK1抗体 | Proteintech | 29338-1-AP | |
| 凝集素拉下 | 琥珀酰化小麦胚芽凝集素 | Vector Laboratories | B-1025S |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G磁珠 | Bimake | B23201 |
| 抗Flag磁珠 | Bimake | B26102 | |
| 抗HA磁珠 | Bimake | B26202 | |
| 凝集素拉下 | sWGA琼脂糖珠 | Vector Laboratories | AL-1023S |
| 染色质制备 | Benzonase核酸酶 | HaiGene | -- |
| 核糖核酸酶A | Sigma | -- | |
| 细胞增殖 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | C0041 |
| Click-iT EdU Alexa Fluor成像试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Sigma | -- |
| 代谢标记 | 1,6-Pr2GalNAz | -- | -- |
| 点击化学 | 炔基-生物素 | Click Chemistry Tools | 1266-25 |
| CuSO4-BTTAA复合物 | Click Chemistry Tools | 1236-500 | |
| 拉下实验 | 对照磁珠 | BEAVER Life Science | 70301 |
| 链霉亲和素磁珠 | BEAVER Life Science | 22308 | |
| 质谱样品制备 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 质谱分析 | timsTOF Pro2质谱仪 | Bruker Daltonics | -- |
| nanoElute高效液相色谱系统 | Bruker | -- | |
| Orbitrap Fusion Lumos质谱仪 | Thermo | -- | |
| EasySpray反相液相色谱柱 | Thermo | -- | |
| Dionex Ultimate 3000 RPLC纳升系统 | Thermo | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 测序 | MiniBEST DNA片段纯化试剂盒 | Takara | 9761 |
| EZ DNA甲基化-Gold试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| PCR | 一步法SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR试剂盒 | Takara | -- |
| 动物实验 | CellBrite NIR790细胞质膜染料 | Biotium | 30079 |
| 抗IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| 抗IGFBP2抗体 | Proteintech | 11065-3-AP | |
| 抗CCND1抗体 | Proteintech | 26939-1-AP | |
| 抗STAG2抗体 | Proteintech | 19837-1-AP |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OIS模型建立 | 细胞类型、hTERT永生化方法、RASG12V诱导系统、doxycycline浓度（2 μg/mL）、诱导时间点 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents; Plasmids, lentiviral production, and transfection |
| O-GlcNAc水平调控 | OGT敲低/过表达、OSMI-4浓度（5 μM）、TMG浓度（50 μM）、处理时间 阅读提示：Methods: Cell culture and reagents; Results section 'Dynamic accumulation...' |
| 多组学分析 | 1,6-Pr2GalNAz浓度（100 μM）、标记时间（48h）、样品量（约3×10^7细胞）、测序平台 阅读提示：Methods: Metabolic labeling and click reaction; COGC-seq/ChIP-seq and bioinformatics |
| 复合物组装验证 | IP抗体、sWGA浓度（1:2000）、凝胶过滤柱（Superose 6）、分子量标准 阅读提示：Methods: Immunoblot/lectin blot and co-immunoprecipitation; Gel filtration-based fractionation |
| 细胞功能实验 | SA-β-Gal染色程序、EdU脉冲时间（2小时）、CCK-8检测、Transwell共培养条件 阅读提示：Methods: Cell proliferation assay; EdU staining and SA-β-galactosidase activity; Transwell cancer growth and scratch experiments |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（裸鼠）、周龄（5周）、细胞数量（A549 2.5×10^6, LU-RAS 5×10^6）、注射部位（左腋窝）、监测时间（28天） 阅读提示：Methods: Xenograft mouse model |