米曲霉发酵与ETO提取纯化
从米曲霉中分离并纯化ETO，并优化发酵条件以提高产量。
采用大米固体发酵米曲霉，经有机溶剂提取、硅胶柱层析和制备型HPLC纯化获得ETO。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
米曲霉产麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮的发酵优化及其通过多通路抑制MyD88/NF-κB/MAPK/NLRP3信号通路的抗炎机制
Fermentation Optimization of Ergosta-4,6,8(14),22-Tetraen-3-One From Aspergillus oryzae and Its Anti-Inflammatory Mechanism via Multi-Pathway Inhibition of MyD88/NF-κB/MAPK/NLRP3 Signaling.
实验完整度
高包含发酵条件优化（单因素、正交实验）和细胞水平功能验证（细胞毒性、NO、炎症因子、Western blot）等多个独立证据层级。
主要模型
RAW264.7小鼠巨噬细胞系 米曲霉（Aspergillus oryzae）发酵体系
重点核对
ETO纯度及含量测定采用HPLC LPS诱导浓度100 ng/mL ETO处理浓度30和40 μg/mL RAW264.7细胞接种密度8×10^4 cells/well Western blot检测蛋白表达（p-JNK、NLRP3、MyD88等）
摘要
米曲霉是生产各种传统食品（包括黄酒、酱油和白酒）的关键微生物。在本研究中，我们使用高效液相色谱法鉴定并定量了来源于米曲霉的生物活性化合物麦角甾-4,6,8(14),22-四烯-3-酮。我们的结果证实，ETO是米曲霉产生的主要成分之一。粗提物的生物活性测定显示，ETO具有显著的抗炎特性。为了提高ETO的产量，我们优化了发酵培养基。单因素实验确定甘油和N-乙酰葡糖胺分别是最佳碳源和氮源。随后采用正交实验设计进一步优化发酵条件，确定了最佳培养基组成。该优化发酵工艺的可行性和有效性得到了验证，为ETO的工业化生产奠定了基础。为了阐明ETO生物活性背后的抗炎机制，在脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中进行了进一步研究。结果表明，ETO显著降低了促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，并抑制了MyD88/NF-κB/MAPK/NLRP3信号通路的激活，表明其具有作为强效抗炎剂的潜力。总之，ETO不仅由米曲霉大量产生，而且表现出显著的抗炎活性，为其未来在抗炎治疗中的开发提供了有前景的基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ETO是否具有抗炎作用及其潜在机制。
- 核心机制
- ETO通过抑制MyD88/NF-κB和MAPK/JNK通路，下调促炎因子表达，并抑制NLRP3炎症小体，从而发挥抗炎作用。
- 主要证据
- 在LPS刺激的RAW264.7细胞中，ETO显著降低NO、IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子水平，并抑制p-JNK、NLRP3、MyD88和p-IκB蛋白表达。
- 研究意义
- ETO作为抗炎治疗剂的潜力，并为工业化生产提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单因素实验优化碳源和氮源
筛选最佳碳源和氮源以提高ETO产量。
分别以不同碳源（甘油、蔗糖等）和氮源（N-乙酰葡糖胺、酵母提取物等）进行发酵，通过HPLC测定ETO含量。
正交实验优化发酵培养基
确定最佳甘油和N-乙酰葡糖胺浓度组合。
采用L9(3^2)正交设计，以甘油浓度和N-乙酰葡糖胺浓度为因素，各设3个水平，测定ETO产量。
ETO对RAW264.7细胞的毒性评估
评估ETO对巨噬细胞的细胞毒性。
不同浓度ETO处理RAW264.7细胞24h，CCK-8法检测细胞活力。
ETO对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎活性评估
验证ETO的抗炎作用并确定最佳浓度。
LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型，ETO共处理，检测NO水平和炎症因子表达。
ETO对炎症因子mRNA表达的影响
检测ETO对促炎因子基因表达的影响。
通过RT-qPCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-β、MCP-1、MIP-2和iNOS的mRNA水平。
ETO对信号通路蛋白表达的影响
探索ETO抗炎作用的分子机制。
Western blot检测NF-κB、MAPK和NLRP3通路相关蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RAW264.7小鼠巨噬细胞系 | Wuhan Pricella Biotechnology Co. Ltd. | CL-0190 |
| DMEM高糖培养基 | Wuhan Punuosi Life Science and Technology Co. Ltd. | PM150210 | |
| 胎牛血清 | Ecocyte Bioscience Co. Ltd. | FND500 | |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Sigma Corporation | L4130 |
| 细胞活性检测 | CCK8检测试剂盒 | Biyuntian Biotechnology Co. Ltd. | BS380A |
| 炎症因子检测 | 一氧化氮检测试剂盒 | Biyuntian Biotechnology Co. Ltd. | S0021S |
| ELISA试剂盒 | Xinbosheng Biotechnology Co. Ltd. | EMC001b | |
| RT-qPCR | 反转录试剂盒 | TaKaRa Corporation | RR047A |
| 蛋白定量 | BCA检测试剂盒 | Yisheng Biotechnology Co. Ltd. | B3101050 |
| 蛋白提取 | RIPA细胞裂解液 | Solabo Technology Co. Ltd. | R0020 |
| 核酸定量 | ND2000 | Quawell Corporation | -- |
| 细胞培养 | Cycle i160细胞培养箱 | -- | -- |
| RT-qPCR | ABI7500实时荧光定量PCR仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 离心 | 高速冷冻离心机 | Eppendorf Corporation | 5810R |
| 发酵培养基 | 马铃薯葡萄糖琼脂 | Guangdong Huanke Microbial Technology Co. Ltd. | -- |
| 马铃薯葡萄糖肉汤 | Guangdong Huanke Microbial Technology Co. Ltd. | -- | |
| 提取 | 乙酸乙酯 | Xilong Technology Co. Ltd. | -- |
| 甲醇 | Xilong Technology Co. Ltd. | -- | |
| 乙酸 | Xilong Technology Co. Ltd. | -- | |
| HPLC | 高效液相色谱仪（1260 Infinity） | Agilent Technologies | -- |
| Welch Ultimate XB-C18色谱柱 | Welch | -- | |
| 柱层析 | SephadexLH-20凝胶柱 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 发酵优化 | 碳源为甘油（浓度35 g/L），氮源为N-乙酰葡糖胺（浓度20 g/L），C/N比1:8，初始pH 7.2-7.4，温度25°C，转速150 r/min 阅读提示：Materials and Methods 2.7, 2.8, Results 3.2, 3.3, Table 1, Table 3 |
| ETO提取纯化 | 提取溶剂比例（乙酸乙酯:甲醇:乙酸=80:15:5），超声时间30min，重复次数4-5次，硅胶柱层析条件（n-己烷:丙酮=4:1） 阅读提示：Materials and Methods 2.5, 2.6 |
| 细胞培养与毒性检测 | 细胞密度8×10^4 cells/well（96孔板），ETO浓度梯度，CCK-8检测时间24h 阅读提示：Materials and Methods 2.11 |
| 抗炎活性检测 | LPS浓度100 ng/mL，ETO浓度30和40 μg/mL，处理时间（LPS刺激4h后共培养24h） 阅读提示：Materials and Methods 2.12, 2.13 |
| 信号通路检测 | 蛋白检测种类（p-Erk1/2, Erk1/2, MyD88, NF-κB, NLRP3, p62, p-IκB, IκB, JNK, p-JNK），内参GAPDH 阅读提示：Materials and Methods 2.15, Results 3.7 |