通过多组学分析解码外泌体核酸递送系统的巨噬细胞自噬与免疫重编程轴

背景：MicroRNA-155（miR-155）是巨噬细胞功能的关键调节因子，其异常表达与结核病（TB）的发病机制密切相关——这是一种巨噬细胞自噬受损削弱抗分枝杆菌免疫的疾病。外泌体因其生物相容性和细胞靶向能力而成为有前景的核酸载体。在此，我们构建了基于外泌体的miR-155递送系统（Exo-miR155-ago/Exo-miR155-antago；“ago”=agomir，一种增强其表达的miR-155激动剂；“antago”=antagomir，一种抑制其表达的miR-155拮抗剂），以调节巨噬细胞自噬并重塑抗结核免疫应答。方法：通过差速离心从骨髓间充质干细胞上清中分离外泌体。使用外泌体转染试剂盒将miR155-5p agomir和antagomir转染至外泌体中，然后与巨噬细胞共孵育。采用转录组学和蛋白质组学筛选差异表达基因和蛋白质。Western blot检测自噬相关蛋白和信号通路中的磷酸化蛋白（p-表示磷酸化，一种调节蛋白质活性的关键翻译后修饰）。采用透射电子显微镜（TEM）、单丹磺酰尸胺（MDC）染色和逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）等技术检测巨噬细胞的自噬水平。结果：转录组测序鉴定出704个差异表达基因，显著富集于TNF和NF-κB通路，NF-κB靶基因（如自噬核心基因Beclin1）差异表达，以及能量代谢相关AMPK/mTOR通路关键基因的表达变化；蛋白质组学分析发现164个差异表达蛋白质，包括“病原体识别-TLR4-NF-κB-自噬相关基因转录”通路的关键分子（TLR4、p-p65）和AMPK/mTOR通路的核心蛋白（p-AMPK、p-mTOR）；功能验证显示，Exo-miR155-ago组具有更多的自噬体（TEM）、更高的自噬空泡积累（MDC染色）、自噬相关分子（LC3B、Beclin1）的mRNA/蛋白质上调、p62的mRNA/蛋白质下调（RT-qPCR/Western blot）、p-p65激活（NF-κB通路）、p-AMPK增加而p-mTOR减少（AMPK/mTOR通路），且所有结果均证实Exo-miR155-ago通过这两条通路的协同作用促进巨噬细胞自噬。结论：本研究为外泌体核酸递送系统介导的自噬调节提供了多组学证据，验证了该系统通过控制TLR4-NF-κB通路和AMPK/mTOR通路调节巨噬细胞自噬，并阐明了该系统在结核病（TB）和其他巨噬细胞相关疾病中的应用潜力。