建立IDD大鼠模型
验证LEP在IDD中的表达变化及椎间盘钙化和骨化情况。
对4月龄SD大鼠进行环形穿刺手术（L3/4, L4/5, L5/6），每椎间盘穿刺3次并注射TNF-α诱导炎症；模型组和2-DG组分别进行假手术或2-DG灌胃（50 mg/kg），8周后取材。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
瘦素通过OCN/HIF-1α轴促进糖酵解调控椎间盘钙化和骨化
Leptin Regulates Intervertebral Disc Calcification and Ossification by Promoting Glycolysis Through OCN/HIF-1α Axis.
实验完整度
高包含体内大鼠模型、体外细胞实验、糖酵解抑制剂和基因敲低等多层级验证，明确了LEP通过OCN/HIF-1α轴促进糖酵解的机制。
主要模型
SD大鼠IDD模型（环形穿刺） 大鼠软骨终板细胞（EPCs）
重点核对
IDD大鼠模型：4月龄SD大鼠，环形穿刺L3/4、L4/5、L5/6椎间盘，每椎间盘穿刺3次，并注射TNF-α（0.1 ng/μL，2.5 μL）诱导炎症；2-DG灌胃剂量50 mg/kg，实验周期8周。 LEP处理浓度：100 ng/mL（HY-P70181）处理EPCs。 2-DG处理浓度：25 mM（HY-13966）处理EPCs。 sh-HIF-1α敲低序列：CGCCTGGCCTTGGACTATATT，用于转染EPCs。 检测指标：ALP、钙、LEP水平（血液），以及OCN、Runx2、BMP-2、Sox9等蛋白和mRNA表达。
摘要
在椎间盘退变（IDD）过程中，软骨终板（CEP）细胞发生钙化和骨化，主要依靠糖酵解提供能量。瘦素（LEP）启动IDD，但其与CEP细胞中糖酵解相关的潜在机制尚不清楚。为了研究LEP对IDD的潜在机制，建立了IDD大鼠模型，并采用添加LEP的CEP细胞，同时使用糖酵解抑制剂（2-DG）和sh-HIF-1α。成功建立大鼠IDD模型，模型组表现出终板钙化、骨化和LEP水平升高。体外实验证实，LEP剂量依赖性地促进CEP细胞的钙化和骨化。LEP还上调钙化相关指标（BMP-2、Sox9）和成骨相关基因（OCN、Runx2），诱导钙化结节形成和ALP活性增加。机制研究表明，IDD大鼠和添加LEP的CEP细胞中，糖酵解相关蛋白和乳酸含量均升高。使用糖酵解抑制剂2-DG可逆转这一过程。进一步实验表明，LEP通过上调OCN/HIF-1α轴促进糖酵解；敲低OCN或HIF-1α均可阻断LEP诱导的钙化和骨化。IDD中LEP升高，LEP通过OCN/HIF-1α轴刺激糖酵解，加速钙化和骨化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LEP是否以及如何通过调控糖酵解影响椎间盘退变中的钙化和骨化过程。
- 核心机制
- LEP通过上调OCN/HIF-1α轴促进糖酵解，从而加速CEP细胞的钙化和骨化。
- 主要证据
- IDD大鼠模型和LEP处理的原代CEP细胞中，LEP水平升高，糖酵解相关蛋白（HK-1、PDK1、p-PDHA/PDHA）和乳酸含量增加；使用2-DG或敲低HIF-1α/OCN可逆转LEP诱导的钙化和骨化指标。
- 研究意义
- 该研究从糖酵解角度揭示了LEP在IDD进展中的潜在机制，为针对LEP、HIF-1α和糖酵解的靶向药物开发提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外LEP处理EPCs
验证LEP对CEP细胞钙化和骨化的影响。
培养大鼠原代EPCs，分别用不同浓度LEP（10, 50, 100, 200 ng/mL）处理24小时，随后选择100 ng/mL进行后续实验，并检测OCN、BMP-2、Sox9、Runx2表达及钙化结节和ALP活性。
抑制糖酵解验证LEP作用
验证LEP是否通过糖酵解促进钙化和骨化。
在IDD大鼠和LEP处理的EPCs中，加入糖酵解抑制剂2-DG（体内灌胃50 mg/kg，体外25 mM），检测LEP、糖酵解相关蛋白（HK-1、PDK1、p-PDHA/PDHA）、乳酸含量、钙化/骨化指标及椎间盘组织学变化。
敲低HIF-1α验证机制
验证HIF-1α是否介导LEP诱导的糖酵解和钙化/骨化。
在LEP处理的EPCs中，使用sh-HIF-1α慢病毒敲低HIF-1α，检测HIF-1α、糖酵解相关蛋白、乳酸含量、OCN和Runx2表达。
敲低OCN验证上游调控
验证OCN是否位于HIF-1α上游并介导LEP作用。
在LEP处理的EPCs中，敲低OCN，检测HIF-1α、糖酵解相关蛋白、乳酸含量、OCN和Runx2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 瘦素 | MCE | HY-P70181 |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MCE | HY-13966 | |
| 唑拉西泮 | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 组织学分析 | 番红O染色 | -- | -- |
| Micro-CT | 微型CT | BRUKER | SkyScan1176 |
| CTVOX软件 | -- | -- | |
| CTAn软件 | -- | -- | |
| 免疫组化 | Runx2抗体 | Affinity | AF5186 |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Solarbio | bc2230 |
| 茜素红染色 | 茜素红S染液 | Solarbio | G1450 |
| 免疫荧光 | Triton-X 100 | Solarbio | T8200 |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| DAPI | Beyotime | C1005 | |
| 血浆分析 | ALP试剂盒 | Mlbio | ml003360 |
| 钙比色检测试剂盒 | Mlbio | ml002969 | |
| LEP试剂盒 | Elabscience | E-BC-K103-M | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 | |
| LEP抗体 | Sigma-Aldrich | L3410 | |
| OCN抗体 | Abcam | ab133612 | |
| HIF-1α抗体 | Abcam | ab308637 | |
| caspase3抗体 | Abcam | ab32351 | |
| caspase9抗体 | Abcam | ab32539 | |
| BMP-2抗体 | Abcam | ab214821 | |
| Sox9抗体 | Abcam | ab185230 | |
| HK-1抗体 | CST | #2024 | |
| PDK1抗体 | Abcam | ab202468 | |
| PDHA抗体 | Abcam | ab168379 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 大鼠品系、年龄、性别（文中未明确说明性别）、手术穿刺次数、TNF-α浓度及体积、2-DG灌胃剂量、实验周期、麻醉药物剂量 阅读提示：见Materials and Methods 2.1节 |
| 细胞培养 | 细胞来源、培养基成分、培养条件、LEP和2-DG处理浓度及时间、sh-HIF-1α序列 阅读提示：见Materials and Methods 2.2节 |
| 组织学分析 | 固定液浓度、固定时间、切片厚度、染色方法 阅读提示：见Materials and Methods 2.3节 |
| Micro-CT | 扫描参数（分辨率、电压、电流、曝光时间）、软件版本 阅读提示：见Materials and Methods 2.4节 |
| 分子检测 | 抗体稀释度、货号、内参基因、引物序列 阅读提示：见Materials and Methods 2.5, 2.10, 2.11节和Table 1 |