SLNT对CRC细胞增殖的抑制作用
评估SLNT对CRC细胞系HCT116和SW620的细胞毒性
使用CCK-8和克隆形成实验检测SLNT处理后细胞活力和克隆形成能力。
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香菇多糖通过结合CD133并抑制CD133/p85/p-AKT信号轴抑制结直肠癌干性
Lentinan inhibits colorectal cancer stemness by binding CD133 and suppressing the CD133/p85/p-AKT signaling axis.
实验完整度
高包含体外细胞增殖与干性实验、CD133敲低/过表达功能验证、LSPR/CETSA/分子对接结合机制验证、体内异种移植瘤模型及信号通路western blot验证。
主要模型
HCT116细胞系 SW620细胞系 SW480细胞系（CD133过表达） HCT116异种移植瘤裸鼠模型
重点核对
SLNT浓度200,400,800 μg/mL处理HCT116和SW620细胞 CD133敲低和过表达细胞系构建及体内验证 LSPR结合实验SLNT与CD133的KD值1.59×10^-7 M CETSA实验SLNT浓度1600 μg/mL处理6小时 动物实验分组及SLNT剂量1 mg/kg、5 mg/kg尾静脉注射
摘要
背景：结直肠癌（CRC）在全球癌症发病率中排名第三。癌症干细胞（CSCs）是CRC复发、转移和治疗耐药的关键驱动因素，而针对它们的治疗仍然有限。香菇多糖因其强大的免疫增强和广谱直接抗肿瘤活性而被广泛认可，然而，它是否具有抑制癌症干性的潜力尚不清楚。方法：选择CRC细胞系HCT116和SW620进行药效学研究。此外，使用肿瘤球形成和有限稀释实验评估SLNT对CRC干性的影响。通过细胞分选以及CD133敲低和过表达实验，确定了SLNT发挥抗CRC作用的关键分子靶点。为进一步阐明潜在分子机制，我们进行了局域表面等离子体共振（LSPR）、细胞热位移分析（CETSA）和分子对接模拟。此外，进行Western blot分析以验证关键信号分子。结果：我们的结果表明，香菇多糖显著抑制CRC细胞系HCT116和SW620的增殖和干性。我们确定CD133是一个关键的功能靶点，并确认了香菇多糖与CD133之间的直接结合相互作用。最后，我们揭示了香菇多糖通过抑制CRC中的CD133/磷脂酰肌醇3-激酶85 kDa调节亚基（p85）/磷酸化AKT丝氨酸/苏氨酸激酶（p-AKT）信号轴来抑制干性。结论：我们的发现不仅为香菇多糖的抗肿瘤机制提供了新的见解，突出了天然多糖在癌症治疗中的科学潜力，也为CRC的临床药物治疗提供了新的选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 香菇多糖（SLNT）是否能抑制结直肠癌干性及其分子机制是什么？
- 核心机制
- SLNT直接结合CD133蛋白并抑制其表达，从而负调控CD133/p85/p-AKT信号轴，抑制CRC细胞干性。
- 主要证据
- SLNT显著抑制HCT116和SW620细胞的增殖和干性（肿瘤球形成和有限稀释实验），通过LSPR和CETSA证实SLNT与CD133直接结合，CD133敲低减弱SLNT的抑制效果，CD133过表达增强效果，体内异种移植瘤实验验证SLNT抑制肿瘤生长并下调p85、p-AKT表达。
- 研究意义
- 为香菇多糖作为抗CRC药物的临床应用提供新依据，并提示其与化疗联合抑制复发转移或用于MSS型CRC免疫治疗耐药的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SLNT对CRC干性的抑制作用
评估SLNT对CRC细胞干性特征的影响
通过肿瘤球形成和有限稀释实验评估SLNT处理后肿瘤球形成能力和球形成效率，并通过免疫荧光检测干性标志物CD133表达。
CD133在SLNT抗CRC效应中的功能验证
验证CD133是否为SLNT发挥抗CRC作用的关键分子靶点
通过CD133敲低和过表达实验，检测SLNT处理后细胞活力和克隆形成能力的变化；通过流式分选获得CD133-和CD133+亚群，比较SLNT对其细胞活力的影响；在体内异种移植瘤模型中比较SLNT对CD133敲低和过表达肿瘤生长的抑制作用。
SLNT与CD133的直接结合验证
验证SLNT是否直接结合CD133蛋白
通过LSPR检测SLNT与CD133的结合动力学，CETSA检测SLNT对CD133热稳定性的影响，免疫荧光检测SLNT与CD133的共定位，分子对接预测结合位点。
体内抗肿瘤效果及信号通路验证
评估SLNT在体内的抗肿瘤效果及对CD133/p85/p-AKT信号轴的影响
建立HCT116异种移植瘤模型，给予不同剂量SLNT，测量肿瘤体积和重量，通过免疫组化检测Ki67表达，通过Western blot检测肿瘤组织中p85、p-Src、p-AKT蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| McCoy's 5a培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 肿瘤球形成 | B27添加剂 | Invitrogen | 17504044 |
| 人表皮生长因子 | PeproTech | AF-100-15-100 | |
| 人成纤维细胞生长因子 | PeproTech | 100-18B-50 | |
| Western blot | 抗CD133抗体 | Abcam | ab278053 |
| 抗p85抗体 | Abcam | ab191606 | |
| 抗磷酸化Src抗体 | Abcam | ab133460 | |
| 抗磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| 流式分选 | CD133/2-PE抗体 | Miltenyi Biotec | 130-112-748 |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Servicebio | -- |
| LSPR | 重组人CD133蛋白 | ACROBiosystems | CD3-H82Q8 |
| 细胞培养 | 超低吸附培养板 | Corning | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| SLNT处理 | SLNT浓度（200、400、800 μg/mL）和处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods 2.1及Results 3.2 |
| 肿瘤球形成和有限稀释实验 | 培养基组成（DMEM/F12含2% B27、20 ng/mL hEGF、20 ng/mL bFGF），细胞接种数（1000/孔、1-1000/孔），培养时间7天 阅读提示：Materials and methods 2.3 |
| CD133敲低/过表达细胞构建 | 慢病毒载体（shCD133、OECD133），嘌呤霉素筛选浓度和筛选时间 阅读提示：Materials and methods 2.5 |
| LSPR | SLNT浓度、流速、结合和解离时间 阅读提示：Materials and methods 2.6 |
| CETSA | SLNT浓度（1600 μg/mL）和处理时间（6小时），温度梯度设置 阅读提示：Materials and methods 2.7 |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、周龄（5周），细胞接种量（6-9×10^6），SLNT剂量（1、5 mg/kg），给药频率（每2天一次共10次） 阅读提示：Materials and methods 2.4 |