样本收集与单细胞测序
构建PTBTs的细胞图谱
收集10例未经治疗的SCC、ACC、IMT患者的肿瘤和正常组织样本，进行scRNA-seq分析。
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单细胞图谱揭示原发性气管支气管肿瘤的肿瘤发生和微环境状态
A single-cell atlas reveals the tumorigenesis and microenvironment status of primary tracheobronchial tumors.
实验完整度
高包含scRNA-seq转录组分析、体外细胞功能实验（增殖、迁移、凋亡）、多重免疫荧光验证等多层级证据。
主要模型
人原发性气管支气管肿瘤组织（SCC、ACC、IMT） 正常气管组织 HBE细胞系 BEAS-2B细胞系 Jurkat T细胞系
重点核对
SCC、ACC、IMT及正常气管组织样本来源 BIRC5+细胞的表达与定位 PPIA过表达对细胞增殖、迁移及T细胞凋亡的影响 CD147/PPIA配体-受体对上调
摘要
原发性气管支气管肿瘤（PTBTs）通常可以通过手术成功治疗；然而，对于晚期肿瘤病例，仍需要更有效的策略。本研究旨在全面了解PTBTs的分子和细胞特征，以及肿瘤微环境（TME）。通过进行单细胞RNA测序，我们揭示了包含52,739个单细胞的PTBTs独特的TME图谱。例如，这三种病理类型被发现具有异质性的成纤维细胞群体，免疫细胞在炎性肌纤维母细胞瘤（IMT）中更加活化。值得注意的是，在原发性气管鳞状细胞癌（SCC）和腺样囊性癌（ACC）样本中鉴定出了一个BIRC5+细胞亚群，其可能具有类似于癌症干细胞（CSCs）的特性。此外，IMT的特征是促炎免疫细胞的浸润，并且可能是一种良性肿瘤。重要的是，基于配体-受体分析，发现PPIA/CD147对在肿瘤和CD8+ T细胞相互作用期间强烈上调。通过对选定标记物应用多重免疫荧光，我们验证了独立细胞实体的存在。我们的发现为PTBTs的生物学提供了更深入的见解，这可能有助于推进PTBTs的诊断和治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 原发性气管支气管肿瘤的细胞组成和肿瘤微环境特征是什么？
- 核心机制
- BIRC5+细胞可能作为祖细胞样细胞，通过CD147/PPIA和CD58/CD2相互作用促进肿瘤增殖、迁移及免疫逃逸。
- 主要证据
- scRNA-seq分析揭示BIRC5+细胞亚群，体外过表达PPIA促进细胞增殖和迁移，并诱导T细胞凋亡。
- 研究意义
- 为PTBTs的发病机制提供新见解，可能有助于开发新的诊断和治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
上皮细胞亚群分析
鉴定SCC和ACC中的肿瘤细胞亚群及其分化状态
对上皮细胞进行再聚类，使用CopyKAT、CytoTRACE和RNA velocity分析。
成纤维细胞亚群分析
探索IMT中成纤维细胞的特征
鉴定出12个成纤维细胞簇，其中3个仅存在于IMT，命名为eCAFs。
内皮细胞分析
比较肿瘤内皮细胞与正常内皮细胞的通路活性
对955个内皮细胞进行再聚类，进行GSVA和SCENIC分析。
T细胞分析
比较不同病理类型中T细胞的免疫状态
鉴定7种T细胞亚型，进行GSVA分析。
B细胞和髓系细胞分析
分析B细胞和巨噬细胞在不同病理类型中的浸润和表型
鉴定B细胞亚型和髓系细胞亚型，进行GSVA分析。
细胞间相互作用分析
鉴定BIRC5+细胞与T细胞之间的关键配体-受体对
使用CellphoneDB预测配体-受体相互作用，并通过多重免疫荧光验证。
体外功能验证
验证PPIA对细胞增殖、迁移和免疫调节的作用
在HBE和BEAS-2B细胞中过表达PPIA，进行CCK-8、克隆形成、划痕和Transwell实验，并与Jurkat细胞共培养。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 单细胞悬液制备 | IV型胶原酶 | -- | -- |
| 木瓜蛋白酶 | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 红细胞裂解液 | MACS | 130-094-183 | |
| 死细胞去除磁珠 | Miltenyi | 130-090-101 | |
| 单细胞测序 | 10x Genomics Chromium单细胞试剂盒(V3) | 10x Genomics | -- |
| 免疫荧光 | 抗BIRC5抗体 | Proteintech | -- |
| 抗CD8抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗EPCAM抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗Ki67抗体 | Proteintech | -- | |
| 抗PPIA抗体 | Proteintech | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | Invent Biotechnologies | -- |
| 牛血清白蛋白检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 抗FGL1多克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| QuickBlock封闭液 | Beyotime | -- | |
| 化学发光辣根过氧化物酶底物 | Millipore | -- | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | NCM Biotech | -- |
| 细胞培养 | 电子细胞计数器 | Olympus | -- |
| Countess II自动细胞计数器 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集与单细胞测序 | 患者样本的病理类型、性别、吸烟史；组织消化酶浓度和时间；单细胞悬液活率>85%；测序平台和文库准备条件 阅读提示：Methods：Human tracheobronchial samples collection, tissue dissociation and preparation of single cell suspensions |
| 细胞培养与PPIA过表达 | 细胞系来源（HBE、BEAS-2B、Jurkat）；培养基和血清浓度；培养温度和CO2浓度 阅读提示：Methods：Cell culture and PPIA overexpression |
| 细胞共培养 | 共培养细胞比例、时间（36小时）、培养基体积 阅读提示：Methods：Cell coculture |
| 细胞功能实验 | CCK-8检测的细胞数、检测波长和时间点；克隆形成实验的接种密度和培养时间；划痕实验的时间点；Transwell实验的细胞数 阅读提示：Methods：Cell Counting Kit 8, Colony formation, Scratch assay, Transwell assay |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释度（1:100）、孵育条件和时间 阅读提示：Methods：Immunofluorescence staining |