细胞培养与处理分组
建立体外卵巢癌细胞模型并设置不同处理条件，以评估药物和细胞的单独及联合效应。
培养人卵巢癌细胞系A2780和SKOV3，并设置对照组、N+I组（4 μg/mL Nivolumab + 4 μg/mL Ipilimumab）和N+I+CIK组（N+I联合5×10⁴ CIK细胞）。
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CIK增强的抗PD1/CTLA4免疫疗法通过三方机制协同根除化疗耐药卵巢癌
CIK-augmented anti-PD1/CTLA4 immunotherapy eradicates chemo-resistant ovarian cancer via tripartite mechanistic synergy.
实验完整度
中包含体外细胞功能实验（增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭），但缺乏体内实验和机制蛋白验证，实验完整性中等。
主要模型
人卵巢癌细胞系A2780 人卵巢癌细胞系SKOV3
重点核对
细胞系：A2780和SKOV3 Nivolumab和Ipilimumab浓度：各4 μg/mL CIK细胞数量：5×10⁴细胞/insert CCK-8增殖实验：3×10³细胞/孔，处理24小时 Transwell侵袭实验：1×10⁵细胞，24小时
摘要
背景：免疫检查点抑制剂（ICIs）联合过继细胞疗法是治疗卵巢癌的有前景的策略，但其协同机制尚未充分探索。本研究评估了Nivolumab/Ipilimumab联合细胞因子诱导杀伤（CIK）细胞在卵巢癌模型中的治疗效果。方法：人卵巢癌细胞（A2780/SKOV3）接受三种处理条件：未处理的对照组、双免疫检查点抑制剂（ICIs：4 μg/mL Nivolumab + 4 μg/mL Ipilimumab）或ICIs联合CIK细胞（5×10⁴细胞/insert），通过CCK-8增殖、transwell侵袭、Annexin V-FITC/PI凋亡检测、碘化丙啶细胞周期分析和定量伤口愈合迁移评估等功能实验评估其影响。结果：三联组合疗法显示出协同疗效，显著降低SKOV3细胞增殖62.3%（P<0.001），在matrigel-transwell实验中抑制侵袭能力71.5%（P<0.01）。同时，在A2780细胞中诱导大量凋亡（增加3.2倍，22.8% vs 对照7.1%），在SKOV3中触发显著的G0/G1期阻滞（55% vs 对照40%），伴随S期耗竭，并在组合治疗组中抑制伤口愈合能力64.7%。结论：三联组合疗法通过强效的G1/S检查点阻断、对ICI耐药群体的选择性细胞毒性以及迁移抑制活性协同增强抗肿瘤疗效，从而确立CIK-ICI联合给药作为晚期卵巢恶性肿瘤的临床可转化策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Nivolumab和Ipilimumab联合CIK细胞是否能协同增强卵巢癌细胞的抗肿瘤效果及其潜在机制。
- 核心机制
- 三重组合疗法通过诱导G1/S期阻滞、对ICI耐药群体的选择性细胞毒性以及抑制迁移活性发挥协同抗肿瘤作用。
- 主要证据
- 体外实验显示，联合治疗可显著抑制SKOV3细胞增殖（62.3%）和侵袭（71.5%），诱导A2780细胞凋亡（3.2倍），并引起G0/G1期阻滞和S期耗竭。
- 研究意义
- 该研究首次探索双ICI（Nivolumab和Ipilimumab）联合CIK细胞治疗卵巢癌的协同作用，为晚期卵巢恶性肿瘤提供了一种临床可转化的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞增殖检测
评估不同处理对卵巢癌细胞增殖能力的影响。
使用CCK-8试剂盒检测细胞增殖，细胞以3×10³/孔接种于96孔板，处理后加入CCK-8试剂孵育2小时，测定450nm吸光度。
细胞凋亡检测
评估不同处理对卵巢癌细胞凋亡的影响。
使用Annexin V-FITC/PI染色和流式细胞术分析细胞凋亡。
细胞周期分析
评估不同处理对卵巢癌细胞周期分布的影响。
使用碘化丙啶（PI）染色和流式细胞术分析细胞周期。
细胞迁移检测
评估不同处理对卵巢癌细胞迁移能力的影响。
使用伤口愈合实验，细胞在ibidi培养皿中生长至融合，划痕后测量0小时和24小时的迁移距离。
细胞侵袭检测
评估不同处理对卵巢癌细胞侵袭能力的影响。
使用matrigel包被的transwell小室进行侵袭实验，细胞接种于上室，24小时后固定、染色并计数侵袭细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Solarbio | 31800 |
| 胎牛血清 | PAN Biotech | P30-3302 | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| CO2培养箱 | SANYO | VMCMMCO-5ACMMO | |
| CIK细胞 | Procell | CP-H228 | |
| 药物处理 | 纳武利尤单抗 | MCE | HY-P9903 |
| 伊匹木单抗 | MCE | HY-P9901 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Solarbio | CA1020 |
| 细胞周期检测 | DNA含量检测试剂盒 | Solarbio | CA1510 |
| 细胞侵袭检测 | 基质胶 | Corning | 356234 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | CK04 |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Solarbio | C8470 |
| 细胞培养 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 流式分析 | BD FACSVerse流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 离心 | 湘仪H1850R高速离心机 | Xiangyi | -- |
| 吸光度检测 | Perlong DNM-9602酶标仪 | Perlong | -- |
| 灭菌 | 申安LDZX-50KBS高压灭菌器 | Shenan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：A2780（ZCL1088）和SKOV3（ZCL1559）；培养基：RPMI 1640含10% FBS和1%青霉素-链霉素；培养条件：37°C、5% CO2 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.1 |
| 药物处理 | Nivolumab浓度：4 μg/mL；Ipilimumab浓度：4 μg/mL；CIK细胞数量：5×10⁴细胞/insert 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.3 |
| 细胞增殖检测 | 细胞密度：3×10³/孔；处理时间：24小时；CCK-8孵育时间：2小时；检测波长：450nm 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4.1 |
| 细胞侵袭检测 | Matrigel稀释：1:8；细胞数量：1×10⁵；侵袭时间：24小时；孔径：8μm 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4.2 |
| 细胞凋亡检测 | 细胞数量：1×10⁵；染色：Annexin V-FITC/PI 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4.3 |
| 细胞周期检测 | 固定：乙醇；染色：RNase A和PI（100μg/mL） 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4.3 |
| 细胞迁移检测 | 细胞密度：3×10⁵/mL；观察时间：0小时和24小时；培养条件：无血清培养基 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.4.4 |
| 统计分析 | 重复数：3次；数据表示：mean ± SD；检验方法：Student's t-test；显著水平：*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 阅读提示：Materials and Methods, Section 2.6 |