检测猪链球菌对EphA2和ZO-1表达的影响
验证猪链球菌是否下调EphA2和紧密连接蛋白ZO-1的表达。
用SC19和D39感染hCMEC/D3和bEnd.3细胞及小鼠，通过免疫印迹和免疫荧光检测EphA2和ZO-1的表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Dcaf15介导的EphA2降解触发猪链球菌脑膜炎期间血脑屏障的破坏
Dcaf15-mediated EphA2 degradation triggers disruption of the blood-brain barrier during Streptococcus suis meningitis.
实验完整度
高包含体外细胞模型（hCMEC/D3、bEnd.3）、体内小鼠模型（EphA2+/+和EphA2-/-）、CRISPR-Cas9敲除、功能验证（TEER、EB染色）及机制验证（泛素化、去乙酰化、磷酸化）等多层证据。
主要模型
hCMEC/D3细胞 bEnd.3细胞 EphA2基因敲除小鼠（EphA2-/-） 野生型C57BL/6J小鼠（EphA2+/+）
重点核对
感染复数（MOI=10）及感染时间（0-6小时） 小鼠感染剂量（2.5×10^8 CFU）和感染途径（腹腔注射） EphA2敲除和过表达细胞系 DCAF15敲低和过表达细胞系 MG132和氯喹（CQ）处理
摘要
血脑屏障（BBB）的破坏是猪链球菌（S. suis）脑膜炎的关键步骤。在这里我们表明，Ephrin A型受体2（EphA2）在抵抗猪链球菌脑膜炎的BBB中发挥重要作用。猪链球菌下调EphA2，且EphA2缺陷在体外和体内加重猪链球菌诱导的BBB破坏。我们确定EphA2介导的自噬减轻猪链球菌诱导的BBB破坏。为了破坏EphA2在BBB中的保护作用，猪链球菌招募E3连接酶DCAF15与EphA2相互作用，诱导EphA2泛素化和降解。机制上，DCAF15促进EphA2在K646、K649和K754位点的K48和K63连接泛素化。此外，猪链球菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（STK）对EphA2降解不可或缺。STK磷酸化组蛋白去乙酰化酶SIRT1的S48位点，触发DCAF15的去乙酰化，增强DCAF15-EphA2相互作用并促进EphA2的泛素化降解，从而破坏BBB。此外，DCAF15在K552和K581位点的乙酰化参与介导EphA2泛素化和BBB稳定性。我们的研究提示EphA2在猪链球菌诱导的BBB破坏中的保护作用，这为开发EphA2作为治疗细菌性脑膜炎的潜在治疗靶点提供了有价值的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EphA2在猪链球菌诱导的血脑屏障破坏中的作用及其分子机制是什么？
- 核心机制
- 猪链球菌通过STK磷酸化SIRT1，促进DCAF15去乙酰化，增强DCAF15与EphA2相互作用，导致EphA2发生K48和K63连接的泛素化降解，从而破坏BBB；而EphA2通过LKB1/AMPK通路介导自噬保护BBB。
- 主要证据
- 体外细胞模型和体内小鼠模型显示EphA2缺陷加重BBB破坏；过表达EphA2恢复ZO-1表达和TEER值；DCAF15过表达促进EphA2泛素化及降解，敲低则减轻；STK敲除减少EphA2降解；SIRT1敲低增加DCAF15乙酰化并减少EphA2泛素化。
- 研究意义
- 揭示EphA2在细菌性脑膜炎中保护BBB的新机制，提示增强EphA2信号或开发EphA2激动剂可能是治疗细菌性脑膜炎的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EphA2对BBB完整性的保护作用
探究EphA2缺失或过表达对猪链球菌诱导的BBB破坏的影响。
使用EphA2敲除细胞和EphA2-/-小鼠，检测ZO-1表达、TEER值、细菌载量和EB渗漏。
探究EphA2介导自噬的机制
验证EphA2是否通过LKB1/AMPK通路调节自噬以保护BBB。
检测EphA2敲除细胞中LC3、P62表达及自噬流，分析AMPK和LKB1磷酸化，并验证EphA2与LKB1相互作用。
鉴定EphA2的E3连接酶DCAF15
筛选并验证与EphA2相互作用并介导其降解的E3泛素连接酶。
通过Co-IP和质谱分析筛选EphA2相互作用蛋白，验证DCAF15与EphA2的相互作用及结构域。
验证DCAF15介导的EphA2泛素化和降解
证明DCAF15通过K48和K63连接的泛素化促进EphA2降解。
检测DCAF15对EphA2蛋白水平的影响，分析泛素化类型和位点，并通过突变体验证。
验证STK对EphA2降解的作用
确定S. suis的STK是否参与EphA2的降解。
感染stk缺失菌株，检测EphA2表达和泛素化水平。
验证SIRT1介导的DCAF15去乙酰化
阐明STK如何通过磷酸化SIRT1促进DCAF15去乙酰化，增强EphA2泛素化。
检测DCAF15乙酰化水平，筛选去乙酰化酶，验证SIRT1磷酸化位点和DCAF15乙酰化位点。
体内验证EphA2保护作用和Crocetin治疗
验证EphA2敲除和Crocetin处理对体内BBB破坏的影响。
使用EphA2-/-小鼠和Crocetin预处理小鼠，检测细菌载量、ZO-1表达和BBB通透性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gbico | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gbico | -- | |
| 细菌培养 | Todd-Hewitt肉汤 | OXOID | CM0189B |
| 胰蛋白胨大豆琼脂 | -- | -- | |
| 蛋白检测 | 抗EphA2抗体 | Cell Signaling Technology | 6997 |
| 抗LC3B抗体 | Cell Signaling Technology | 3868T | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 抗磷酸化AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK（ERK1/2）(Thr202/Tyr204)抗体 | Cell Signaling Technology | 4370T | |
| 抗p44/42 MAPK（ERK1/2）抗体 | Cell Signaling Technology | 4695T | |
| 抗AMPKα抗体 | Cell Signaling Technology | 5831 | |
| 抗磷酸化AMPKα（Thr172）抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| 抗磷酸化LKB1（Ser334）抗体 | Cell Signaling Technology | 3055 | |
| 抗DYKDDDDK标签抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗P62/SQSTM1抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| 抗STK11/LKB1抗体 | Proteintech | 10746-1-AP | |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| 抗SIRT1抗体 | Proteintech | 60303-1-Ig | |
| 抗HA标签多克隆抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗Myc抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗DYKDDDDK抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Proteintech | 17168-1-AP | |
| 抗磷酸化（Ser/Thr）抗体 | Abcam | ab117253 | |
| 抗P300抗体 | Abcam | ab275378 | |
| 抗泛素抗体 | Santa Cruz | sc-8017 | |
| 抗乙酰赖氨酸抗体 | PTM BIO | PTM-105RM | |
| 抗DCAF15抗体 | Sigma | -- | |
| 药物处理 | 3-甲基腺嘌呤 | MCE | HY-19312 |
| 雷帕霉素 | MCE | HY-10219 | |
| MG-132 | MCE | HY-13259 | |
| 氯喹 | MCE | HY-17589A | |
| Pim1/AKK1-IN-1 | MCE | HY-10371 | |
| 藏红花酸单甲酯 | MCE | HY-N6904 | |
| 二甲基亚砜 | MCE | HY-Y0320 | |
| 免疫沉淀 | 抗Myc亲和凝胶 | Beyotime | P2285 |
| 蛋白A+G琼脂糖 | Beyotime | P2055 | |
| GST标签纯化树脂 | Beyotime | P2251 | |
| 细胞裂解 | NP-40裂解液 | Beyotime | P0013F |
| 免疫沉淀 | 抗DYKDDDDK G1亲和树脂 | GenScript | L00432 |
| 转染 | Lipomaster 293转染试剂 | Vazyme | JC3001 |
| RT-qPCR | ChamQ Blue通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312 |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000008 |
| 蛋白表达 | SIRT1融合蛋白 | Proteintech | Ag17677 |
| STK11融合蛋白 | Proteintech | Ag1048 | |
| RT-qPCR | FastPure细胞/组织总RNA提取试剂盒V2 | Vazyme | -- |
| HiScript IV All-in-One Ultra RT超混液 | Vazyme | -- | |
| qPCR | CFX96 | Bio-Rad | -- |
| 动物实验 | 伊文思蓝 | Sigma | -- |
| 免疫荧光 | 0.1% Triton X-100 | -- | -- |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG（H&L）Alexa fluor 488 | Abcam | -- | |
| 山羊抗兔IgG（H&L）Alexa fluor 594 | Abcam | -- | |
| 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 显微镜 | 共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
| 透射电镜 | JEM-1400-FLASH透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 细胞培养 | Transwell-Clear插入小室 | Corning Costar | -- |
| TEER测量 | Millicell-ERS电阻系统 | Millipore | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌感染细胞 | 感染复数（MOI=10）和感染时间（0-6小时） 阅读提示：见Methods 'Cell culture and bacterial infection' |
| 体内感染 | 小鼠数量、感染剂量（2.5×10^8 CFU）、感染途径（腹腔注射）、感染时间（48小时） 阅读提示：见Methods 'Bacterial infection in vivo' |
| EphA2敲除细胞 | CRISPR-Cas9靶序列、筛选浓度和周期 阅读提示：见Methods 'The generation of EphA2−/− hCMEC/D3 cells' |
| 药物处理 | 3-MA浓度5 mM、BafA1浓度50 nM、Rapa浓度20 μM、Crocin剂量20 mg/kg 阅读提示：见Methods 'Cell culture and bacterial infection'和Fig. 3P |
| 蛋白质印迹 | 抗体稀释度和孵育时间 阅读提示：见Methods 'Western blotting' |
| 免疫共沉淀 | 裂解缓冲液（NP-40）和抗体使用 阅读提示：见Methods 'Co-immunoprecipitation (Co-IP) and GST affinity-isolation assays' |
| TEER测量 | 细胞培养天数（7-10天）和TEER阈值（>200 Ω/cm2） 阅读提示：见Methods 'Endothelial cell permeability assay in vitro using transwell model' |