鉴定HIA相关基因
利用多组学数据鉴定缺氧诱导血管生成相关基因。
整合HIF1A/HIF2A ChIP-seq、缺氧条件下的RNA-seq差异表达分析及SRGA方法，筛选出12个重叠基因作为HIA相关基因。
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多组学分析鉴定结直肠癌中以甘露糖磷酸异构酶为中心的缺氧诱导血管生成特征。
Multi-omics analyses identify mannose phosphate isomerase-centered hypoxia-induced angiogenesis signature in colorectal cancer.
实验完整度
高综合多组学数据分析、体外细胞功能实验、体内异种移植瘤模型及免疫组化验证，涵盖基因表达、蛋白互作、功能表型及信号通路验证。
主要模型
HCT116结肠癌细胞系 HUVEC人脐静脉内皮细胞 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型 CRC患者多组学数据（bulk RNA-seq、单细胞、空间转录组）
重点核对
缺氧诱导：CoCl2处理HCT116细胞（125或250 µM，12-24小时）以模拟缺氧 MPI敲低：shRNA转染HCT116细胞，嘌呤霉素筛选（2.5 µg/mL，2天） 体内模型：BALB/c裸鼠皮下注射5×10^6个HCT116细胞（sh-scramble或sh-MPI），16天后取材 功能检测：集落形成、管形成、免疫组化（Ki67和CD31） 蛋白互作：Co-IP验证MPI与LDHA相互作用
摘要
背景：缺氧和血管生成是癌症的关键特征，在结直肠癌（CRC）的发生和发展中起关键作用。然而，缺氧诱导血管生成（HIA）的转录机制仍不清楚。本研究旨在探讨HIA相关基因的调控网络、分子机制和预后价值。方法：我们收集了多组学数据，包括染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、批量RNA-seq、单细胞RNA-seq、空间转录组学和来自CRC患者和细胞系的微阵列数据。利用单样本基因集富集分析（ssGSEA）、特征相关基因分析（SRGA）、共识聚类等计算方法，探讨缺氧与血管生成的相关性，鉴定HIA相关基因，并建立基于HIA相关基因的风险评分系统。通过定量实时PCR（RT-qPCR）、免疫共沉淀（Co-IP）、Western blot、集落形成、管形成实验和皮下异种移植瘤模型，在体外和体内验证了甘露糖磷酸异构酶（MPI）的作用。结果：我们鉴定了12个HIA相关基因，它们被缺氧诱导因子（HIFs）转录激活，并在功能上参与CRC的血管生成。基于HIA相关CRC亚型之间的差异表达基因，我们构建了一个称为HIAscore的预后评分系统。HIAscore高的患者与不良生存、侵袭性表型和免疫抑制性肿瘤微环境相关。空间分析揭示了上皮细胞（HIAscore较高）与T/I/NK细胞之间的隔离区域，阻碍了它们的浸润。特别是，发现MPI与乳酸脱氢酶A（LDHA）相互作用，并通过磷酸化和激活Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3（JAK2/STAT3）信号通路促进CRC的增殖和血管生成。结论：本研究描绘了CRC中连接缺氧和血管生成的转录景观，并确定MPI是该过程的新型调节因子。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 缺氧诱导血管生成（HIA）在结直肠癌中的转录调控机制及其预后价值是什么？
- 核心机制
- MPI与LDHA相互作用，通过磷酸化激活JAK2/STAT3信号通路，促进CRC细胞的增殖和血管生成。
- 主要证据
- 通过多组学分析鉴定12个HIA相关基因，构建HIAscore；体外实验（RT-qPCR、Western blot、Co-IP、集落形成、管形成）和体内异种移植瘤模型显示MPI敲低抑制增殖和血管生成，并降低JAK2/STAT3通路蛋白磷酸化水平。
- 研究意义
- MPI作为连接缺氧与血管生成的新型调节因子，可能成为结直肠癌的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HIA相关基因表达
验证12个HIA相关基因在缺氧条件下的表达变化及其对HIF-1α的依赖性。
通过RT-qPCR和Western blot检测HIF-1α及12个HIA相关基因的表达，并使用shRNA敲低HIF-1α观察其影响；通过管形成实验评估培养上清对内皮细胞血管生成的影响。
构建HIAscore预后模型
基于HIA相关基因表达构建风险评分系统，评估其预后价值。
基于12个HIA相关基因表达进行共识聚类，确定3个CRC亚型；对亚型间差异表达基因进行单因素Cox回归，筛选预后相关基因，并通过PCA构建HIAscore。
评估HIAscore与临床病理特征及TME的关系
分析HIAscore与患者预后、临床特征及肿瘤免疫微环境的关系。
使用Kaplan-Meier生存分析、多因素Cox回归、ESTIMATE、ssGSEA、IOBR和空间转录组分析等，评估HIAscore与生存、分期、MMR状态、CMS亚型及免疫细胞浸润的相关性。
单细胞和空间分析HIAscore
在单细胞和空间水平上解析HIAscore的表达异质性及其与免疫细胞的空间关系。
对scRNA-seq数据重新分析，对上皮细胞亚聚类并计算HIAscore，进行拟时序分析和CellChat细胞通讯分析；使用SPOTlight对空间转录组进行反卷积，定位HIAscore及免疫细胞。
验证MPI功能
验证MPI对CRC细胞增殖和血管生成的影响及其分子机制。
在HCT116中敲低MPI，进行集落形成、管形成实验，并通过Western blot检测JAK2/STAT3信号通路蛋白；建立皮下异种移植瘤模型，评估MPI敲低对肿瘤生长和血管生成的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | Excell Bio | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Beyotime | -- | |
| 内皮细胞培养基 | Procell | -- | |
| 内皮细胞生长因子 | Procell | -- | |
| 细胞转染 | pLKO.1-shMPI载体 | Tsingke Biological Technology Co., Ltd | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| PMD2.G包装质粒 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 集落形成实验 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 磷酸盐缓冲液 | -- | -- | |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 管形成实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 钙黄绿素AM | Beyotime | -- | |
| RT-qPCR | 细胞总RNA提取试剂盒 | Foregene | -- |
| HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| ChamQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | -- | -- | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | -- | |
| LDHA抗体 | proteinTech | 19987-1-AP | |
| MPI抗体 | proteinTech | 14234-1-AP | |
| JAK2抗体 | Abcam | ab108596 | |
| STAT3抗体 | Abcam | ab68153 | |
| 磷酸化JAK2抗体 | Abcam | ab32101 | |
| 磷酸化STAT3抗体 | Abcam | ab32143 | |
| GAPDH抗体 | ZSGB-BIO | TA-08 | |
| β-actin抗体 | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS凝胶成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| Co-IP | Protein A/G磁珠 | MedChemExpress | -- |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | HUAFUKANG | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与缺氧诱导 | HCT116细胞使用DMEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素；缺氧诱导用125或250 µM CoCl2处理12-24小时；HUVEC使用专用培养基。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 基因敲低 | 使用shRNA敲低MPI或HIF-1α；转染293T细胞包装病毒；HCT116感染后用2.5 µg/mL嘌呤霉素筛选2天。 阅读提示：Methods: Plasmid vector construction and cell transfection |
| 功能实验 | 集落形成实验种植3×10^3个细胞/6孔板，培养2周；管形成实验用Matrigel包被96孔板，HUVEC预先处理2天，种植2.5×10^4个细胞，孵育12小时。 阅读提示：Methods: Colony formation assay, Tube formation assays |
| 蛋白检测 | Western blot使用20 µg蛋白/孔，抗体稀释度均为1:1000；Co-IP使用相应抗体和Protein A/G磁珠。 阅读提示：Methods: Western blot, Co-immunoprecipitation |
| 体内实验 | BALB/c裸鼠（4-6周龄）皮下注射5×10^6个HCT116细胞；肿瘤大小每三天测量一次，16天后取材；IHC检测Ki67和CD31。 阅读提示：Methods: Mouse model |
| 统计分析 | 所有实验重复三次，数据以平均值±SD表示；两组间比较用Wilcoxon检验或t检验，三组间用ANOVA；生存分析用log-rank检验。 阅读提示：Methods: Statistical analysis |