筛选YAP的CRL E3连接酶
确定YAP是否受CRL调控以及具体由哪个CRL复合物介导
使用MLN4924和MG132处理膀胱癌细胞，检测YAP蛋白水平；siRNA敲低六种Cullin，过表达显性负性Cullin，检测YAP蛋白水平和半衰期。
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FBXO9以GSK-3β依赖性方式介导YAP的泛素化和降解
FBXO9 mediated the ubiquitination and degradation of YAP in a GSK-3β-dependent manner.
实验完整度
高包含体外细胞模型（膀胱癌、结肠癌、HEK293、MEFs）的多层级验证，涵盖蛋白互作、泛素化、激酶磷酸化、功能与化疗敏感性实验。
主要模型
膀胱癌细胞系（T-24、5637、HT-1197） HEK293细胞 HCT116结肠癌细胞 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）
重点核对
MLN4924处理浓度1 μM，时间24小时 MG132处理浓度5 μM或10 μM，时间24小时或20 μM处理6小时 CHX浓度50 μg/ml 低糖（1 mM）加二甲双胍（5 mM）处理 PI3K抑制剂（perifosine、AZD2014、MK-2206 2HCl）处理
摘要
Hippo信号通路效应因子YAP（Yes相关蛋白）是一种关键的转录调控因子，参与包括肿瘤发生在内的多种生物过程。尽管YAP具有作为治疗靶点的潜力，但药理学靶向Hippo/YAP轴仍然具有挑战性，需要进一步探索调控YAP的机制。在本研究中，我们确定了Cullin-RING E3连接酶复合物SCF-FBXO9-CRL1是YAP稳定性的新型翻译后调控因子。机制上，FBXO9通过保守的降解决定子基序识别YAP，并促进其在赖氨酸76（K76）位点的K48连接的多聚泛素化，从而促进蛋白酶体降解。值得注意的是，我们证明了GSK-3β对YAP在Ser338和Thr342位点的磷酸化为FBXO9识别YAP提供了前提，进而导致随后的泛素化。此外，我们对信号级联的分析揭示，Akt激酶活性通过影响GSK-3β的磷酸化状态来调节这一调控轴。Akt信号的药理学抑制导致YAP以GSK-3β/FBXO9依赖的方式降解，显著增强了癌症模型中的化疗敏感性。这些发现建立了一个先前未识别的涉及Akt、GSK-3β、FBXO9和YAP的调控轴，控制YAP蛋白的周转，为将Akt抑制剂与常规化疗药物联合的治疗策略提供了机制基础。我们的工作增进了对YAP翻译后调控的理解，并确定了YAP驱动的恶性肿瘤的几个潜在治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP如何通过泛素-蛋白酶体途径被调控，以及这一调控是否可被用于增强膀胱癌的化疗敏感性？
- 核心机制
- GSK-3β磷酸化YAP的Ser338和Thr342，形成磷酸化降解决定子，被FBXO9识别，进而促进YAP在K76位点的K48连接多聚泛素化，导致蛋白酶体降解；Akt信号通过抑制GSK-3β活性来稳定YAP，抑制Akt则可促进YAP降解。
- 主要证据
- 通过MLN4924和MG132处理、Cullin敲低/显性负性突变、免疫共沉淀、泛素化检测、半衰期测定、体外激酶实验等，证明FBXO9与YAP互作并介导其泛素化降解；细胞活力实验和PARP裂解实验表明FBXO9/YAP轴调控增殖和吉西他滨敏感性。
- 研究意义
- 揭示Akt/GSK-3β/FBXO9/YAP调控轴，为联合Akt抑制剂与常规化疗药物治疗YAP驱动的恶性肿瘤提供了机制基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证FBXO9与YAP的相互作用
验证FBXO9是否为识别YAP的F-box蛋白，并确定结合区域
过表达Flag标记的F-box蛋白，进行Flag-bead免疫沉淀检测内源YAP；沉默FBXW7或FBXO9观察对彼此结合的影响；内源IP检测FBXO9与YAP互作；免疫荧光共定位；构建FBXO9截短突变体，IP确定结合区域。
验证FBXO9对YAP蛋白水平的影响
验证FBXO9是否负向调控YAP蛋白表达
敲低或敲除FBXO9检测YAP蛋白水平；过表达FBXO9检测YAP蛋白水平；使用HCT116细胞和MEFs验证普适性。
检测FBXO9对YAP半衰期和泛素化的影响
验证FBXO9是否通过泛素-蛋白酶体途径缩短YAP半衰期并促进其泛素化
沉默FBXO9后用CHX处理检测YAP半衰期；体内泛素化实验检测YAP泛素化水平；使用野生型和突变型泛素（K48或K63）确定连接类型。
鉴定YAP上的FBXO9结合基序和泛素化位点
确定FBXO9与YAP结合的具体区域和泛素化位点
构建YAP截短突变体，IP确定结合区域为TA结构域；点突变S338A/T342A验证phosphodegron功能；构建14个赖氨酸突变体，泛素化实验确定K76为主要位点。
验证GSK-3β对YAP磷酸化和降解的作用
验证GSK-3β是否通过磷酸化YAP促进其与FBXO9结合及降解
使用GSK-3β抑制剂或siRNA敲低GSK-3β，检测YAP水平、FBXO9结合和泛素化；过表达GSK-3β检测YAP降解；体外激酶实验证实GSK-3β直接磷酸化YAP。
检测应激条件对YAP表达的影响
验证应激条件（低糖、二甲双胍、缺氧）是否能通过激活GSK-3β/FBXO9轴促进YAP降解
低糖和二甲双胍处理检测YAP水平；缺氧处理检测YAP水平、FBXO9结合和泛素化；敲低GSK-3β或FBXO9观察对YAP降解的拯救效果。
评估Akt/GSK-3β/FBXO9/YAP轴对细胞增殖和化疗敏感性的影响
验证Akt信号是否通过GSK-3β/FBXO9/YAP轴影响膀胱癌细胞增殖和化疗敏感性
敲低YAP或FBXO9检测细胞活力；使用PI3K抑制剂处理检测YAP水平、半衰期和凋亡标志物（cleaved PARP）；与吉西他滨联合处理检测细胞凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证蛋白相互作用
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| MEM非必需氨基酸 | -- | -- | |
| 转染 | 脂质体3000 | Life Technologies | -- |
| 药物处理 | MLN4924 | Selleck Chemicals | S7109 |
| MG132 | Selleck Chemicals | S2619 | |
| TDZD-8 | Selleck Chemicals | S2926 | |
| 替地格韦 | Selleck Chemicals | S2823 | |
| TWS119 | Selleck Chemicals | S1590 | |
| 吉西他滨 | Selleck Chemicals | S1714 | |
| 哌立福辛 | Selleck Chemicals | S1037 | |
| AZD2014 | Selleck Chemicals | S2783 | |
| 蛋白质印迹 | 抗Cul1抗体 | Cellular Signaling Technology | 4995 |
| 抗Cul3抗体 | Cellular Signaling Technology | 10450 | |
| 抗Cul4A抗体 | Cellular Signaling Technology | 2699 | |
| 抗Cul4B抗体 | Abcam | ab317014 | |
| 抗Cul5抗体 | Abcam | ab264284 | |
| 抗YAP抗体 | Cellular Signaling Technology | 4912 | |
| 抗GSK-3β抗体 | Cellular Signaling Technology | 9315 | |
| 抗磷酸化GSK-3β抗体 | Cellular Signaling Technology | 5558 | |
| 抗HIF-1抗体 | Cellular Signaling Technology | 3716 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cellular Signaling Technology | 2146 | |
| 抗Flag抗体 | Cellular Signaling Technology | 14793 | |
| 抗Myc抗体 | Cellular Signaling Technology | 5605 | |
| 抗泛素抗体 | Cellular Signaling Technology | 3936 | |
| 抗HA抗体 | Cellular Signaling Technology | 3724 | |
| 抗GST抗体 | Cellular Signaling Technology | 2622 | |
| 抗Akt抗体 | Cellular Signaling Technology | 9272 | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cellular Signaling Technology | 4060 | |
| 抗PARP抗体 | Cellular Signaling Technology | 9541 | |
| 抗FBXO9抗体 | Abcam | ab115521 | |
| 抗Cul2抗体 | Abcam | ab166917 | |
| 抗NEDD8抗体 | Abcam | ab194582 | |
| 免疫沉淀 | c-Myc AC磁珠 | MedChemExpress | HY-K0206 |
| 抗Flag M2亲和磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 | |
| Pierce Ni-NTA磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 78605 | |
| Sepharose G磁珠 | Abcam | ab193262 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnologies | -- |
| SDS-PAGE凝胶 | Epizyme Biotechnolgia | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 快速蛋白印迹试剂盒 | GeneScript | -- | |
| 化学发光试剂盒 | Beyotime Technologies | -- | |
| 免疫共沉淀 | 免疫共沉淀裂解液 | Beyotime Technologies | -- |
| 磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| 体外激酶实验 | GST-YAP融合蛋白 | -- | -- |
| 谷胱甘肽-Sepharose 4B | Life Technologies | -- | |
| PD-10 Sepharose G-25 | Life Technologies | -- | |
| 激酶缓冲液 | Cell Signaling Technology | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Beyotime Biotechnologies | -- | |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Qiagen | -- | |
| SYBR超混液 | Takara | -- | |
| QuantStudio实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞活力实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | -- |
| 酶标仪 | BioTek | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 激光共聚焦显微镜LSM 5 Pa | Carl Zeiss | -- | |
| 质粒构建 | 一步法SuperClone试剂盒 | Hieff BioTech | -- |
| QuickMutation plus试剂盒 | Beyotime Biotechnologies | -- | |
| pCMV5-Flag载体 | -- | -- | |
| pLKO.1载体 | -- | -- | |
| psPAX2 | -- | -- | |
| pMD2G | -- | -- | |
| pGEK-2TK质粒 | Beyotime | -- | |
| 蛋白表达 | BL21(DE3)感受态大肠杆菌 | Beyotime Biotechnologies | -- |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（Pricella Biotechnology、Shanghai Bank of Cell Lines、Beyotime），培养基（RPMI 1640、DMEM），血清浓度，抗生素浓度，培养条件（5% CO2，37°C），传代密度 阅读提示：Methods: Cell culture and transfections |
| 药物处理 | MLN4924浓度和持续时间（1 μM，24小时）；MG132浓度（5 μM、10 μM、20 μM）和处理时间；CHX浓度（50 μg/ml）；GSK-3β抑制剂（TDZD-8、TWS119、tideglusib）浓度和处理时间未明确说明；PI3K抑制剂（perifosine、AZD2014、MK-2206 2HCl）浓度未明确说明 阅读提示：Results 相应图注（Figure 1, 5, 8）和Methods: Antibodies, chemical reagents, plasmids, and siRNAs |
| 转染 | 转染试剂（Lipofectamine 3000），质粒和siRNA浓度未明确说明，转染时间（通常24小时） 阅读提示：Methods: Cell culture and transfections; 图注 |
| 泛素化实验 | MG132处理浓度（10 μM或20 μM）和时间（6或7小时），裂解缓冲液成分，Ni-NTA beads孵育条件 阅读提示：Methods: Protein ubiquitination assay |
| 体外激酶实验 | GST-YAP蛋白表达和纯化步骤，激酶反应条件（ATP类型、温度、时间），底物和酶量未明确说明 阅读提示：Methods: GST pull-down and in vitro phosphorylation assays; Figure 6 |
| 应激处理 | 低糖浓度（1 mM），二甲双胍浓度（5 mM），处理时间（24小时），缺氧条件（1% O2）和处理时间（1或4小时） 阅读提示：Results 相应图注（Figure 7） |