体外抗病毒活性验证
评估依鲁替尼在多种细胞系中对VACV复制的抑制作用。
在HeLa、A549、THP-1、HFF细胞中，分别以3或0.01 pfu/cell感染VACV-WR，同时加入不同浓度依鲁替尼（0.5-20 μM），DMSO作对照；感染后24或48小时收获病毒，通过空斑实验测定滴度，并利用MTT法检测细胞活力。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
依鲁替尼通过靶向布鲁顿酪氨酸激酶抑制多种痘病毒的复制
Ibrutinib inhibits the replication of multiple poxviruses by targeting the Bruton tyrosine kinase.
实验完整度
高包含体外多种细胞系实验、体内小鼠模型、机制研究（DNA复制、蛋白质合成、BTK磷酸化与核转位）、基因敲低/过表达及突变体验证。
主要模型
HeLa细胞 A549细胞 BALB/c小鼠 HFF细胞
重点核对
依鲁替尼浓度（0.5-20 μM）和MOI（3或0.01 pfu/cell） BTK siRNA敲低（80 nM）和BTK过表达（0.1-1 μg质粒） BTK突变体（Y223F、C481Y、Y551F）影响病毒复制 小鼠感染剂量（2×10^4 pfu VACV-WR）和依鲁替尼给药剂量（0.625-2.5 mg/kg）
摘要
近期全球猴痘（mpox）暴发的激增凸显了开发针对正痘病毒感染的抗病毒药物的迫切需求。依鲁替尼（Ibrutinib）是一种选择性布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）抑制剂，最初于2013年获得FDA批准用于治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）和套细胞淋巴瘤（MCL），基于对痘苗病毒（VACV）的高通量筛选，已成为一种潜在的抗病毒候选药物。本研究评估了依鲁替尼对VACV、猴痘病毒（MPXV）和结节性皮肤病病毒（LSDV）的抗病毒能力，证明其对多种痘病毒具有强大的抗病毒活性。体外实验证实，依鲁替尼在多种细胞系中显著抑制VACV、MPXV和LSDV的复制。使用VACV感染的BALB/c小鼠进行的体内研究表明，依鲁替尼治疗延长了存活期，减轻了体重减轻和病变形成，并降低了感染小鼠的病毒载量。机制研究表明，依鲁替尼抑制了病毒早期和晚期蛋白质合成以及DNA复制。此外，BTK的调控影响病毒复制，强调了依鲁替尼通过细胞靶标的抗病毒作用。值得注意的是，在痘病毒感染期间观察到BTK磷酸化和核转位，表明其在病毒复制中的作用。总的来说，我们的发现表明依鲁替尼是治疗痘病毒感染的候选药物，其细胞靶标BTK有助于痘病毒复制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 依鲁替尼是否通过靶向BTK抑制多种痘病毒（VACV、MPXV、LSDV）的复制，并减轻体内致病性？
- 核心机制
- 依鲁替尼抑制BTK磷酸化及其核转位，从而抑制病毒DNA复制和晚期蛋白合成；BTK通过抑制I型干扰素反应促进痘病毒复制。
- 主要证据
- 体外实验显示依鲁替尼抑制VACV、MPXV和LSDV复制，小鼠模型中延长存活、减轻体重下降和器官病毒载量；BTK敲低降低病毒滴度，过表达增强病毒复制；BTK突变体丧失促病毒能力。
- 研究意义
- 依鲁替尼是治疗多种痘病毒感染的潜在候选药物，靶向宿主因子BTK可能降低耐药风险，为药物再利用提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
广谱抗病毒活性评估
检测依鲁替尼对其他DNA病毒和RNA病毒的抑制作用。
使用MPXV、MVA、LSDV、HSV-1和VSV感染相应细胞（HeLa、DF-1、MDBK、Vero），加入不同浓度依鲁替尼，24或48小时后通过空斑实验或TCID50测定病毒滴度，并评估细胞活力。
病毒生命周期阶段分析
确定依鲁替尼作用于病毒复制的哪个阶段。
通过时间添加实验、qPCR检测病毒DNA和mRNA、Western blot检测病毒蛋白合成来评估依鲁替尼的影响，并用AraC作为阳性对照。
体内抗病毒效果评估
评估依鲁替尼对VACV感染小鼠的保护作用。
BALB/c小鼠经鼻内感染VACV-WR（2×10^4 pfu），每日给予依鲁替尼（0.625、1.25、2.5 mg/kg）或PBS，监测生存率和体重变化；感染后第5天测定各器官病毒载量，第2天进行肺组织H&E和免疫组化分析。
BTK功能验证
验证BTK在痘病毒复制中的作用。
通过siRNA敲低或质粒过表达BTK，或使用CRISPR-Cas9敲除BTK，然后感染VACV或MPXV，检测病毒蛋白合成和病毒滴度。
BTK磷酸化和突变分析
检测VACV感染是否诱导BTK磷酸化，并确定关键位点对促病毒功能的影响。
感染后检测p-BTK水平；将BTK野生型和突变体转染至BTK-KO细胞，检测病毒DNA、病毒产量和蛋白表达。
BTK亚细胞定位分析
观察VACV感染是否引起BTK核转位及其机制。
使用共聚焦显微镜和细胞核质分离实验检测BTK的定位，并比较BTK突变体（Y223F、Y551F）的定位差异。
I型干扰素反应评估
探究依鲁替尼是否通过BTK调节I型干扰素反应。
HFF细胞敲低BTK或过表达BTK，感染WR-ΔE3，检测IFN-α、IFN-β及ISG表达水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 依鲁替尼 | Selleck | S2680 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | -- |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| 细胞活力 | MTT检测试剂盒 | Solarbio | M1020 |
| 蛋白质印迹 | SDS裂解液 | Beyotime | -- |
| PMSF | Beyotime | -- | |
| FastPAGE预制胶 | Tsingke Biotechnology | -- | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | Bio-Rad | -- | |
| SuperSignal West Dura底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DNA/RNA提取 | QIAamp DNA Blood迷你试剂盒 | Qiagen | 51104 |
| RNA提取 | RNAprep纯细胞/细菌试剂盒 | TIANGEN | DP430 |
| 逆转录 | 第一链cDNA合成SuperMix | TransGen | AE301-03 |
| qPCR | TOROGreen qPCR预混液 | -- | -- |
| 共聚焦显微镜 | ProLong Diamond抗淬灭剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 核质分离 | 核质分离试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| 流式细胞术 | Hoechst染料 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外抗病毒实验 | 细胞系、MOI（3或0.01 pfu/cell）、依鲁替尼浓度（0.5-20 μM）、感染时间（24或48 hpi）、病毒滴定方法 阅读提示：Methods: Viral infection and titration; Figure legends 1 |
| 体内实验 | 小鼠品系和性别（7-8周龄雌性BALB/c）、感染剂量（2×10^4 pfu）、依鲁替尼剂量（0.625-2.5 mg/kg）、给药途径（鼻内）、监测时间和终点 阅读提示：Materials and Methods: In vivo anti-VACV-WR activity of ibrutinib; Figure 4 |
| BTK调控实验 | siRNA浓度（80 nM）、过表达质粒剂量（0.1-1 μg）、转染时间（24或48 h）、感染MOI和时长 阅读提示：Materials and Methods: BTK knockdown and overexpression; Figure 5 |
| 机制研究 | 时间点（2,8 hpi）用于DNA和mRNA检测；病毒蛋白检测时间（2或8 hpi）；AraC浓度（40 μg/mL） 阅读提示：Results: Ibrutinib targets viral DNA replication; Figure 3 |
| 干扰素反应实验 | 细胞系（HFF）、感染MOI（0.01或3 pfu/cell）、感染时间（0-24 h）、依鲁替尼浓度（10 μM）、siRNA和质粒转染条件 阅读提示：Results: Ibrutinib treatment primes the type I interferon response; Figure 8 |