BSAb构建与表征
评估不同scFv配置的bsAb与RBD蛋白的结合亲和力。
使用7F3和GW01构建了四种bsAb（G7-Fc, 7G-Fc, G-Fc-7, 7-Fc-G），通过ELISA和BLI测定其与不同变体RBD的结合能力。
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结构引导的双特异性抗体工程赋予对KP.3.1.1和sarbecoviruses的广泛保护
Structure-guided bispecific antibody engineering confers broad protection against KP.3.1.1 and sarbecoviruses.
实验完整度
高包含体外假病毒中和实验、活病毒中和实验、冷冻电镜结构解析、位点突变验证及小鼠体内预防和治疗实验，证据层级多样，功能与机制验证完整。
主要模型
HEK 293T细胞 Huh-7细胞 K18-hACE2转基因小鼠 BA.2.86刺突三聚体
重点核对
G7-Fc抗体的scFv配置（(scFv)2-Fc格式） G7-Fc对KP.2假病毒的中和活性（IC50为0.18 nM） G7-Fc对EG.5活病毒的中和活性 G7-Fc在hACE2转基因小鼠中的预防和治疗效果（i.p. 200 μg/小鼠，i.n. 20 μg/小鼠） A227S/T和Y229N突变对KP.3.1.1中和活性的恢复
摘要
自然学科；生物科学；生物化学；免疫学；微生物学；病毒学；结构生物学
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- scFv序列排列和位置如何影响双特异性抗体（bsAb）的结构和功能，以及能否通过结构引导设计产生广谱中和抗体来应对SARS-CoV-2变体。
- 核心机制
- G7-Fc通过其两个scFv同时结合刺突三聚体上两个不同且保守的表位，诱导刺突三聚体形成顶端对顶端的二聚体，构象锁定在开放状态，阻断RBD与ACE2的相互作用，从而发挥广谱中和作用。
- 主要证据
- 冷冻电镜结构显示BA.2.86刺突三聚体与G7-Fc形成三聚体-二聚体复合物；关键残基突变导致中和活性显著降低（30倍至>4237倍）；体内实验中，G7-Fc预防和治疗给药均显著降低EG.5感染小鼠的肺病毒载量。
- 研究意义
- 该研究为设计针对SARS-CoV-2变体和sarbecoviruses的有效广谱双特异性抗体提供了结构框架，并展示了利用结构信息快速优化抗体以应对新出现变体的可能性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中和活性测定
评估四种bsAb对多种假病毒和活病毒的中和效力和广度。
使用22种假病毒（包括SARS-CoV, WIV1, RS3367）进行中和实验，并检测对EG.5活病毒的中和能力。
结构解析
解析G7-Fc与BA.2.86刺突三聚体复合物的结构，阐明中和机制。
通过负染电镜和冷冻电镜解析了BA.2.86 S三聚体与G7-Fc的复合物结构，包括整体结构和局部精细结构。
表位与关键残基突变验证
验证G7-Fc两个scFv结合的关键残基对中和活性的贡献。
对GW01和7F3表位中的关键残基进行单点突变，并测定G7-Fc对这些突变假病毒的中和活性。
结构引导的抗体优化
恢复G7-Fc对KP.3.1.1的中和活性。
基于结构分析，在G7-Fc的7F3 scFv中引入A227S/T和Y229N突变，并检测对KP.3.1.1假病毒的中和活性。
体内药效评估
评估G7-Fc对EG.5感染的预防和治疗效果。
在K18-hACE2转基因小鼠中，通过腹腔或鼻内给药，在感染前或感染后24小时给予G7-Fc，48小时后检测肺部病毒载量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Ez trans转染试剂 | Life-iLab | AC04L092 | |
| 蛋白纯化 | 蛋白G琼脂糖珠 | Smart-Lifesciences | SA020200 |
| Ni琼脂糖高性能介质 | Cytiva | 17526801 | |
| ELISA | ABTS溶液 | Thermo Fisher | 002024 |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgG | Jackson ImmunoResearch | 109-035-098 | |
| 流式细胞术 | CD19 PE-Cy7抗体 | BD Biosciences | 341113 |
| IgA-APC抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-135-011 | |
| IgM-PE抗体 | Jackson ImmunoResearch | 709-116-073 | |
| IgD-FITC抗体 | BD Biosciences | 562023 | |
| 分子克隆 | PrimeSTAR HS DNA聚合酶 | Takara | R010A |
| 一步法PCR克隆试剂盒 | NOVOProtein | NR005 | |
| BLI | AHC传感器 | Sartorius | 18-5060 |
| 蛋白纯化 | HisTrap HP亲和层析柱 | GE Healthcare | -- |
| Superose 6 increase 10/300凝胶过滤柱 | GE Healthcare | -- | |
| 冷冻电镜 | TITAN Krios G4透射电镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Falcon 4i相机 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Selectris X成像过滤器 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 动物实验 | K18-hACE2-2A-CreERT2 C57BL/6J小鼠 | Cyagen | C001244 |
| 细胞株 | Huh-7细胞 | Pricella | CL-0120 |
| Freestyle 293F细胞 | Thermo Fisher | R79007 | |
| HEK 293T细胞 | ATCC | CRL-3216 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 双特异性抗体构建 | scFv序列排列方式：G7-Fc为GW01 VL-(G4S)3-GW01 VH-(G4S)4-7F3 VL-(G4S)3-7F3 VH-Hinge-CH2-CH3 阅读提示：Methods：Construction of bsAbs |
| 中和试验 | 细胞系：Huh-7；假病毒孵育时间：12小时；发光检测：48小时后；稀释：5倍系列稀释 阅读提示：Methods：Neutralization assay |
| 冷冻电镜结构解析 | 复合物形成比例：1:1.3摩尔比；孵育条件：4°C 0.5小时；纯化：凝胶过滤；样品浓度：0.5 mg/mL 阅读提示：Methods：Formation of BA.2.86 S-G7-Fc complex, Cryo-EM sample preparation |
| 体内实验 | 小鼠品系：K18-hACE2转基因小鼠（5-6周龄雌性）；给药剂量：i.p. 200 μg/小鼠，i.n. 20 μg/小鼠；感染剂量：105 FFU EG.5；给药时间：感染前或感染后24小时 阅读提示：Methods：Evaluation of the prophylactic and therapeutic efficacy of G7-Fc in vivo |