建立TSDO小鼠模型并进行中性粒细胞耗竭
验证机械牵引是否增加ZMS区域中性粒细胞浸润，以及中性粒细胞在TSDO诱导的骨形成中的作用。
对4周龄C57BL/6小鼠进行TSDO手术，设置对照组（sham）、牵引组（DO）和中性粒细胞耗竭组（NIDO）。NIDO组腹腔注射抗Ly6G抗体，DO和对照组注射同型对照。术后1、3、7天取材。
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机械力通过Jun阳性中性粒细胞分泌Oncostatin M促进颅面骨再生治疗面中部发育不全
Mechanical force-induced oncostatin M secretion by Jun-positive neutrophils promotes craniofacial bone regeneration for midface hypoplasia treatment.
实验完整度
高包含体内TSDO小鼠模型、中性粒细胞耗竭模型、单细胞测序、体外细胞拉伸实验及成骨分化验证，多层级证据支持机制结论。
主要模型
C57BL/6小鼠TSDO模型 中性粒细胞耗竭小鼠模型 dHL-60细胞（DMSO诱导分化） SuSCs（缝间充质干细胞）
重点核对
中性粒细胞耗竭处理：抗Ly6G抗体（200 μg/只，术前2天，之后隔日100 μg至牵引后7天） 拉伸参数：10%应变、0.5 Hz正弦波、6小时 PI3K抑制剂wortmannin（50 μM）和AKT抑制剂MK2206（50 μM）处理 OSM重组蛋白（10 ng/ml）处理 样本量：每组至少3个独立生物学重复
摘要
背景：面中部发育不全是一种常见的颅面畸形。经颅缝牵引成骨术（TSDO）通过施加机械力刺激颧上颌缝（ZMS）处的骨形成，已成为一种有效的治疗策略。然而，TSDO诱导的成骨机制仍不清楚，导致治疗时间延长和临床应用受限。方法：在4周龄C57BL/6小鼠和中性粒细胞耗竭小鼠中建立TSDO模型，以研究中性粒细胞在ZMS骨再生中的作用。使用单细胞RNA测序表征TSDO期间中性粒细胞的动态和异质性，并通过CellChat分析识别细胞间信号通路。此外，使用分化的HL-60细胞进行体外拉伸实验，评估中性粒细胞的机械敏感行为。结果：在TSDO模型中，机械牵引显著增加了ZMS和周围骨髓中的中性粒细胞浸润。中性粒细胞耗竭损害了牵引诱导的骨形成。单细胞测序显示，Jun+中性粒细胞亚群（Jun-Neu）通过分泌Oncostatin M（OSM）促进缝间充质干细胞（SuSCs）的成骨分化。在体外，机械拉伸（10%，0.5 Hz）激活中性粒细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-AKT通路，增强OSM释放并促进SuSCs的成骨分化。结论：本研究确定了TSDO中的机械力-中性粒细胞-骨再生轴，强调了Jun-Neu来源的OSM在促进成骨中的关键作用。这些发现为优化基于TSDO的临床策略提供了理论见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TSDO中机械力如何通过影响中性粒细胞促进ZMS骨再生？
- 核心机制
- 机械力通过激活PI3K-AKT通路促进Jun+中性粒细胞分化并分泌OSM，OSM与SuSCs上的OSMR/LIFR结合，促进其成骨分化。
- 主要证据
- TSDO小鼠模型显示中性粒细胞浸润增加，耗竭后骨形成减少；scRNA-seq鉴定Jun-Neu亚群分泌OSM；体外拉伸dHL-60细胞激活PI3K-AKT并促进OSM分泌；SuSCs在OSM或条件培养基下成骨分化增强。
- 研究意义
- 为优化TSDO临床方案提供理论基础，并提示OSM可作为增强骨形成、缩短治疗时间的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序分析中性粒细胞异质性
表征TSDO过程中ZMS内中性粒细胞的动态变化和亚群异质性，并识别关键的细胞间通讯通路。
收集对照组和DO组ZMS组织，进行scRNA-seq，经质量控制、CCA整合、PCA降维和UMAP可视化，聚类细胞并亚聚类中性粒细胞，进行功能评分、拟时间分析、CellChat分析。
体外培养和分化HL-60细胞为中性粒细胞样细胞
建立可用于体外拉伸实验的中性粒细胞模型，以模拟体内机械力环境。
HL-60细胞用1.25% DMSO或1 μmol/L ATRA诱导分化4-6天，通过Giemsa染色和流式细胞术检测CD11b表达验证分化效果。
机械拉伸3D培养的dHL-60细胞
探究不同幅度机械牵张对中性粒细胞形态、活性、Jun表达和OSM分泌的影响，并验证PI3K-AKT通路的作用。
dHL-60细胞包埋于I型胶原中进行3D培养，施加不同应变（0%、8%、10%、12%）的循环拉伸（0.5 Hz）6小时。通过SEM观察形态，Calcein/PI染色检测活性，ELISA检测OSM分泌，RT-qPCR检测Jun基因表达。并加入PI3K抑制剂wortmannin或AKT抑制剂MK2206验证通路。
验证机械力通过OSM促进SuSCs成骨分化
验证OSM信号在机械力条件下对SuSCs成骨分化的促进作用。
SuSCs在拉伸（10%应变）条件下培养，并添加重组OSM蛋白（10 ng/ml），检测成骨标志物。另外，收集dHL-60细胞在0%或10%拉伸条件下的条件培养基，与成骨诱导培养基混合（1:1），处理SuSCs 14天，进行茜素红S染色。
评估体内OSM和成骨相关基因表达
验证体内TSDO过程中OSM上调及其与中性粒细胞的关系，并评估中性粒细胞对成骨的影响。
对ZMS组织进行RT-qPCR检测OSM、RUNX2、ALP、PI3K-AKT通路相关基因；IHC检测OSM、BMP2。micro-CT检测骨密度、ZMS宽度、颧弓长度；Masson染色评估新骨形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TSDO模型制作 | 镍钛诺丝 | Beijing NiTi Nuo Technology Co., Ltd | -- |
| 单细胞制备 | II型胶原酶 | Sigma | V900892-100MG |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma | DN25-1G | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 单细胞测序 | SeekOne® MM 单细胞3'文库制备试剂盒 | SeekGene | SO01V3.1 |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | HyClone | -- |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10437085 | |
| IMDM培养基 | Pricella | PM150510 | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 细胞分化 | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| 全反式维甲酸 | -- | -- | |
| 流式细胞术 | Zombie Violet™ 可固定活力染料 | BioLegend | 423113 |
| FITC标记抗小鼠Ly6G抗体 | Elabscience | E-AB-F1108C | |
| APC标记抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 157605 | |
| PerCP标记抗小鼠/人CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081F | |
| 流式细胞仪（Accuri C6） | BD Biosciences | -- | |
| 细胞染色 | 吉姆萨染色液 | Solarbio | G1010 |
| 3D培养与拉伸 | 大鼠尾I型胶原 | Cellvis | 200110-50 |
| 10倍磷酸盐缓冲液 | Solarbio | P1022-500ml | |
| 拉伸室 | Dongdi Beijing Technology Co., Ltd | -- | |
| 拉伸仪（CELL TANK） | Dongdi Beijing Technology Co., Ltd | -- | |
| 细胞活力检测 | Calcein/PI细胞活力检测试剂盒 | Beyotime | C2015S |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜（JSM-IT200） | JEOL | -- |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| PrimeScript反转录试剂盒 | Takara | RR047A | |
| QuantiNova SYBR Green PCR预混液 | Qiagen | 208054 | |
| 实时荧光定量PCR仪（Biorad CFX） | Biorad | -- | |
| ELISA | OSM酶联免疫吸附测定试剂盒 | Cloud-Clone Corp | SEA110Hu |
| 机制研究 | 渥曼青霉素 | Selleck | S2758 |
| MK-2206 | Selleck | S1078 | |
| 成骨分化 | 重组OSM蛋白 | Cloud-Clone Corp | RPA110Mu01 |
| 抗坏血酸 | -- | -- | |
| 甘油磷酸盐 | -- | -- | |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| 茜素红S染色液 | Solarbio | G1452 | |
| 组织学 | EDTA | Servicebio | G1105 |
| 抗Ly6G抗体（IHC） | Abclonal | A22270 | |
| 抗BMP2抗体 | Abclonal | A0231 | |
| 抗OSM抗体 | Proteintech | 27792-1-AF | |
| HRP标记二抗 | ZSGB-bio | -- | |
| DAB显色试剂 | ZSGB-bio | -- | |
| O.C.T.包埋剂 | SAKURA | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Beyotime | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| CD11b抗体（IF） | Abcam | ab133357 | |
| 细胞计数 | 荧光细胞分析仪（Countstar® Rigel S2） | Countstar | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TSDO动物模型 | 小鼠周龄（4周龄）、性别（雄性）、品系（C57BL/6）、体重（14-15g）、牵引装置尺寸（0.25mm镍钛诺丝）、牵引力（30g）、手术方法（钻孔位置、装置放置）、麻醉剂量（0.3%戊巴比妥钠150 μl/10g） 阅读提示：Materials and methods: Animals and treatments |
| 中性粒细胞耗竭 | 抗Ly6G抗体（Clone 1A8）剂量（200 μg/只，术前2天；之后100 μg隔日）、给药方式（腹腔注射）、给药时间（至术后7天）、对照组（同型IgG2a） 阅读提示：Materials and methods: Animals and treatments; Results: Fig. 2A |
| 单细胞RNA测序 | 组织来源（ZMS）、消化酶（胶原酶II、DNase I）、红细胞去除、文库制备试剂盒（SeekOne® MM）、测序平台（Illumina NovaSeq 6000）、质控标准（基因数>200、UMI bottom 1%、线粒体比例<20%） 阅读提示：Materials and methods: Single-cell RNA sequencing |
| 体外拉伸实验 | 细胞类型（dHL-60细胞，1.25% DMSO诱导6天）、3D培养条件（I型胶原包埋）、拉伸参数（正弦波0.5 Hz、应变8%、10%、12%、6小时）、对照组（未拉伸） 阅读提示：Materials and methods: Stretching of dHL-60 cells |
| SuSCs成骨分化实验 | SuSCs来源（6只4周龄小鼠ZMS）、培养条件（20% FBS高糖DMEM）、拉伸参数（10%应变、0.5 Hz、6小时/天、14天）、条件培养基制备（dHL-60上清与成骨诱导培养基1:1）、OSM蛋白浓度（10 ng/ml）、成骨诱导成分（50 μg/mL抗坏血酸、10 mM甘油磷酸盐、0.1 mM地塞米松） 阅读提示：Materials and methods: Osteogenic differentiation of SuSCs |
| PI3K-AKT通路验证 | 抑制剂浓度（wortmannin 50 μM、MK2206 50 μM）、处理时间（拉伸期间）、检测指标（OSM分泌、相关基因表达） 阅读提示：Materials and methods: ELISA; Results: Fig. 6H |