数据获取和HPI构建
利用转录组数据识别与幽门螺杆菌感染和肿瘤微环境相关的基因,并建立预后指数。
从TCGA和GSE62254获取胃癌转录组数据,通过WGCNA和差异表达分析筛选基因,使用LASSO Cox回归构建HPI。
Transcriptional profiling reveals H.pylori-associated genes induced inflammatory cell infiltration and chemoresistance in gastric cancer.
包含生物信息学分析、细胞功能实验(siRNA敲低、药物敏感性)、临床样本验证(IHC/IF/流式)和单细胞RNA测序等多个独立证据层级。
胃癌细胞系HGC-27和MKN45 胃癌患者组织样本 单细胞RNA测序数据
细胞系:HGC-27和MKN45 siRNA敲低ACSM5和HSPB2 药物处理:5-氟尿嘧啶(50 μM)和紫杉醇(2.5 nM)处理24小时 细胞活力检测:CCK-8试剂 凋亡检测:Annexin V/PI染色
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
利用转录组数据识别与幽门螺杆菌感染和肿瘤微环境相关的基因,并建立预后指数。
从TCGA和GSE62254获取胃癌转录组数据,通过WGCNA和差异表达分析筛选基因,使用LASSO Cox回归构建HPI。
验证HPI与胃癌患者预后的关联。
基于HPI分组进行Kaplan-Meier生存分析和Cox回归分析,并在临床样本中验证ACSM5和HSPB2表达。
评估HPI相关基因对化疗药物敏感性的影响。
通过siRNA敲低ACSM5和HSPB2,检测细胞对5-氟尿嘧啶和紫杉醇的活力和凋亡变化。
探究HPI与肿瘤微环境免疫细胞浸润的关系。
使用多种算法(CIBERSORT等)评估免疫细胞浸润,并通过单细胞RNA测序和临床样本验证。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Procell | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 5-氟尿嘧啶 | -- | -- |
| 紫杉醇 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Topscience | -- |
| Bio-Rad酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin V/PI凋亡检测试剂盒 | BD Pharmingen | -- |
| 流式分析 | Fortessa-X20流式细胞仪 | BD | -- |
| CytoFlex S流式细胞仪 | BD | -- | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| 抗ACSM5抗体 | Proteintech | 67334-1-lg | |
| 抗HSPB2抗体 | Proteintech | 21755-1-AP | |
| β-actin抗体 | CST | 3700 | |
| 抗小鼠二抗 | Bio-Rad | 1706516 | |
| 抗兔二抗 | Abcam | ab150077 | |
| 增强化学发光试剂 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫组化 | 胃酶 | Maxim | DIG-3009 |
| 超敏SP试剂盒 | Maxim | KIT-9730 | |
| 抗ACSM5抗体 | Proteintech | 67334-1-lg | |
| 抗HSPB2抗体 | Proteintech | 21755-1-AP | |
| 增强DAB显色试剂盒 | Maxim | DAB-2032 | |
| 免疫荧光 | 抗CD80抗体 | Abcam | ab270113 |
| 抗iNOS抗体 | Abcam | ab3523 | |
| 山羊抗兔IgG | Abcam | ab150077 | |
| DAPI染色液 | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 组织消化 | 胰蛋白酶-EDTA溶液 | BI | 2122153 |
| Hank's缓冲液 | Procell | 1803241 | |
| IV型胶原酶 | Gibco | 2357210 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | 37326-33-3 | |
| 分散酶 | Gibco | 2309419 | |
| 80 μm细胞过滤器 | Biosharp | 22131209 | |
| ACK裂解缓冲液 | Solarbio | R1010 | |
| 流式分析 | 抗人CD45抗体 | Invitrogen | 2317050 |
| 抗人CD11b抗体 | Invitrogen | 2191966 | |
| 抗人CD15抗体 | Biolegend | 301904 | |
| 抗人CD16抗体 | Biolegend | 302012 | |
| 抗人CD273抗体 | Biolegend | 316718 | |
| 抗人siglec 8抗体 | Biolegend | 347104 | |
| 可固定活力染料 | Invitrogen | 2365395 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 培养基、血清、培养条件 阅读提示:Methods: Cell lines and culture conditions |
| siRNA转染 | siRNA序列、转染试剂、转染时间 阅读提示:Methods: siRNA and transfection |
| 药物敏感性检测 | 药物浓度、处理时间、检测方法 阅读提示:Methods: Cell viability assessment and drug sensitivity assessment |
| 凋亡检测 | 处理条件、染色流程、流式分析 阅读提示:Methods: Flow cytometry |
| 免疫组织化学 | 抗体克隆号、稀释度、抗原修复条件 阅读提示:Methods: Immunohistochemistry |
| 流式细胞术 | 抗体组合、样本消化条件、染色步骤 阅读提示:Methods: Flow cytometry |