EVs的分离与表征
获得并验证多房棘球绦虫来源的EVs。
培养原头节（PSCs），收集培养基并通过差速离心纯化EVs，使用NTA和TEM分析粒径和形态，通过western blot检测EV标志物CD9和CD63。
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多房棘球绦虫来源的细胞外囊泡中的Emu-miR-10a-5p通过LIF介导的JAK1-STAT3信号抑制巨噬细胞M2a极化，从而减轻过敏性哮喘小鼠的气道炎症。
Emu-miR-10a-5p in Echinococcus multilocularis-derived-extracellular vesicles alleviates airway inflammation in mice with allergic asthma by inhibiting macrophage M2a polarization through LIF-mediated JAK1-STAT3 signaling.
实验完整度
高包含体外细胞实验（MH-S细胞M2a极化模型、双荧光素酶报告基因、siRNA/过表达LIF、联合转染）、转录组测序、体内OVA诱导哮喘模型及组织病理、流式、免疫荧光等验证。
主要模型
MH-S细胞M2a极化模型 OVA诱导过敏性哮喘小鼠模型 E. multilocularis原头节来源EVs
重点核对
EVs纯化及表征（NTA、TEM、western blot检测CD9/CD63） MH-S细胞M2a极化诱导条件（IL-4和IL-13各20 ng/mL） emu-miR-10a-5p模拟物转染浓度及时间 OVA致敏和激发方案（剂量、时间、给药方式） LIF靶向验证（双荧光素酶报告基因）
摘要
引言：寄生虫和寄生虫来源的细胞外囊泡（EVs）和微小RNA（miRNAs）可以预防炎症性疾病，如哮喘。M2a巨噬细胞促进过敏性哮喘的发展。miR-10a-5p与哮喘密切相关，而emu-miR-10a-5p（包裹在多房棘球绦虫EVs中）与人类和小鼠成熟miRNA共享种子位点序列。方法：我们通过离心纯化EVs，并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）和透射电子显微镜（TEM）对EVs进行表征。我们使用MH-S细胞构建M2a极化模型。通过转录组测序分析用emu-miR-10a-5p模拟物转染后MH-S细胞的基因表达变化。我们建立了卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型。使用苏木精和伊红（H&E）、Masson三色和过碘酸-雪夫（PAS）染色检测肺组织中的气道炎症。通过RT-qPCR、流式细胞术和Western Blot实验验证相关基因和蛋白的表达。结果：我们观察到多房棘球绦虫来源的EVs及其包裹的emu-miR-10a-5p转录本抑制巨噬细胞M2a极化。我们还发现emu-miR-10a-5p靶向白血病抑制因子（LIF）mRNA并抑制下游Janus激酶1（JAK1）-信号转导和转录激活因子3（STAT3）信号通路。我们建立了卵清蛋白（OVA）诱导的过敏性哮喘小鼠模型，发现emu-miR-10a-5p减轻了过敏性哮喘小鼠的肺部炎症，同时抑制了肺部M2a巨噬细胞的积聚。emu-miR-10a-5p干预抑制了过敏性哮喘小鼠肺中的LIF和JAK1-STAT3信号。讨论：这些发现提示，包裹在多房棘球绦虫EVs中的emu-miR-10a-5p可能通过靶向结合LIF，经JAK1-STAT3通路跨物种调节M2a巨噬细胞极化，从而减轻过敏性哮喘小鼠的气道炎症。这些发现增进了目前对感染期间免疫调节机制和免疫稳定性维持的理解。关键词：哮喘，细胞外囊泡，白血病抑制因子（LIF），M2a巨噬细胞，emu-miRNA-10a-5p。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 多房棘球绦虫来源的EVs及其携带的emu-miR-10a-5p能否以及如何调节过敏性哮喘中的M2a巨噬细胞极化？
- 核心机制
- emu-miR-10a-5p通过靶向结合LIF mRNA，抑制JAK1-STAT3信号通路，从而抑制M2a巨噬细胞极化。
- 主要证据
- 体外MH-S细胞实验显示emu-miR-10a-5p抑制M2a标志物表达和M2a比例，双荧光素酶报告基因验证LIF为直接靶点，LIF siRNA和过表达实验证实LIF-JAK1-STAT3通路调控M2a极化；体内OVA诱导哮喘模型证实emu-miR-10a-5p减轻气道炎症并抑制M2a积累。
- 研究意义
- 这些发现增进了对感染期间免疫调节机制和免疫稳定性维持的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外M2a极化模型建立及EVs和emu-miR-10a-5p的作用
验证EVs和emu-miR-10a-5p对M2a巨噬细胞极化的影响。
使用IL-4和IL-13诱导MH-S细胞M2a极化，与EVs共培养或转染emu-miR-10a-5p mimics，通过RT-qPCR和流式细胞术检测M2a标志物。
转录组测序筛选靶基因及验证
鉴定emu-miR-10a-5p的靶基因及信号通路。
对MH-S细胞进行转录组测序，比较空白组、M2a极化组和转染emu-miR-10a-5p的M2a组，筛选差异基因，并通过双荧光素酶报告基因验证LIF为直接靶点。
验证LIF对M2a极化的调控
确认LIF是否通过JAK1-STAT3信号调控M2a极化。
通过LIF siRNA敲低和OE-LIF过表达，检测JAK1-STAT3信号和M2a标志物表达。
联合转染验证emu-miR-10a-5p与LIF的相互作用
验证emu-miR-10a-5p通过LIF-JAK1-STAT3轴发挥作用。
将emu-miR-10a-5p mimics与OE-LIF共转染MH-S细胞，观察M2a极化和JAK1-STAT3信号的变化。
体内OVA诱导哮喘模型及emu-miR-10a-5p干预
评估emu-miR-10a-5p对过敏性哮喘小鼠气道炎症的影响。
建立OVA诱导的过敏性哮喘小鼠模型，通过尾静脉注射emu-miR-10a-5p agomir，通过组织病理染色、ELISA、流式细胞术等评估炎症反应和M2a极化。
验证体内M2a极化和LIF-JAK1-STAT3信号
验证emu-miR-10a-5p在体内抑制M2a极化和LIF-JAK1-STAT3信号。
分析小鼠肺组织中M1/M2a巨噬细胞比例、M2a相关基因表达以及LIF、JAK1、STAT3的表达，并通过免疫荧光检测LIF在巨噬细胞中的表达。
初步探究对T细胞分化的影响
探究emu-miR-10a-5p对CD4+ T细胞分化的影响。
将转染emu-miR-10a-5p的巨噬细胞与脾脏Naïve CD4+ T细胞共培养，通过流式细胞术检测Th1/Th2细胞比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 去外泌体胎牛血清 | VivaCell | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio Science & Technology | -- | |
| EVs分离 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | -- | -- |
| 诱导M2a极化 | 白细胞介素-4 | BioLegend | -- |
| 白细胞介素-13 | BioLegend | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 动物模型 | 卵清蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| 氢氧化铝 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| emu-miR-10a-5p激动剂 | GenePharma | -- | |
| 阴性对照激动剂 | GenePharma | -- | |
| 细胞培养 | MH-S细胞（小鼠肺泡巨噬细胞） | ProCell | CL-0597 |
| HEK293T细胞 | -- | -- | |
| T细胞分离 | 小鼠脾脏淋巴细胞分离培养基试剂盒 | Tianjin Haoyang Biopharmaceutical | -- |
| 小鼠初始CD4+ T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 流式分析 | FACSCelesta流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| FlowJo软件 | -- | -- | |
| PE-抗F4/80抗体 | BioLegend | -- | |
| APC-抗CD206抗体 | BioLegend | -- | |
| FITC-抗CD11c抗体 | BioLegend | -- | |
| APC-抗siglec-F抗体 | BioLegend | -- | |
| APC-抗CD3抗体 | BioLegend | -- | |
| FITC-抗CD4抗体 | BioLegend | -- | |
| PE-抗IL-4抗体 | BioLegend | -- | |
| PerCp-cy5.5-抗IFN-γ抗体 | BioLegend | -- | |
| 含Brefeldin A的细胞活化鸡尾酒试剂 | BioLegend | -- | |
| 胞内染色破膜洗涤缓冲液 | BioLegend | -- | |
| BV421-抗CD86抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| APC-cy7-抗CD45抗体 | BD Pharmingen | -- | |
| ELISA | 小鼠OVA特异性IgE ELISA试剂盒 | Nanjing Boyan Biotechnology | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNAprep纯组织试剂盒 | TianGen | -- | |
| RT-qPCR | PrimeScript™ RT预混液 | Takara Biomedical Technology | -- |
| Bestar® SYBR Green qPCR预混液 | DBI® Bioscience | -- | |
| All-in-One miRNA RT-qPCR检测试剂盒 | GeneCopoeia | -- | |
| Western blot | 总蛋白提取试剂盒 | KeyGEN | -- |
| BCA蛋白测定试剂盒 | KeyGEN | -- | |
| 抗LIF抗体 | Abcam | ab113262 | |
| 抗JAK1抗体 | Abcam | ab133666 | |
| 抗STAT3抗体 | Abcam | ab68153 | |
| 抗CD9抗体 | Cell Signaling Technology | 13174 | |
| 抗CD63抗体 | Cell Signaling Technology | 52090 | |
| 抗p-JAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 74129 | |
| 抗p-STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9145 | |
| 抗β-actin抗体 | Bioworld Technology | BS6007MH | |
| 二抗 | Bioworld Technology | BS20241-Y | |
| ECL检测试剂盒 | KeyGen Biotech | -- | |
| ChemiDoc Touch成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | psiCHECK-2质粒 | Promega | -- |
| Dual Glo双荧光素酶检测系统 | Promega | -- | |
| 组织染色 | 10%福尔马林 | -- | -- |
| 免疫荧光 | 抗F4/80抗体 | Abcam | ab300421 |
| 抗Arg1抗体 | Abmart | TD6657 | |
| 抗LIF抗体 | Abcam | ab113262 | |
| Cy3偶联山羊抗兔二抗 | Proteintech | -- | |
| DAPI | Beyotime | -- | |
| 全景切片扫描仪（PANNORAMIC MIDI） | 3DHISTECH | -- | |
| 数据统计 | GraphPad Prism 8.0软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EVs分离与表征 | 原头节培养条件（DMEM含30%去外泌体FBS）、差速离心参数（1500、2000、10000、120000 × g，各30、30、60、90分钟，4°C）。 阅读提示：Methods: Isolation and characterization of EVs |
| M2a极化模型 | MH-S细胞代数、IL-4和IL-13浓度（20 ng/mL）、处理时间（至少48小时）。 阅读提示：Methods: Cell culture; Results: Figure 3 |
| emu-miR-10a-5p转染 | mimics浓度、转染试剂（Lipofectamine 3000）及用量、转染时间。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| OVA诱导哮喘模型 | OVA剂量（致敏20μg，激发100μg）、Al(OH)3体积（50μL）、致敏和激发时间点（第0、7、14天；第21-33天隔天）、agomir注射剂量（3 OD）和途径（尾静脉）。 阅读提示：Methods: Animals and treatments; Figure 1 |
| LIF靶向验证 | 双荧光素酶报告基因质粒构建（psiCHECK-2-LIF-3'UTR）、共转染用量（emu-miR-10a-5p mimic 50 ng）、检测时间（48小时）。 阅读提示：Methods: Dual-luciferase reporter assay |
| 组织病理分析 | 肺组织固定（10%福尔马林）、包埋、切片厚度、染色方案（H&E、Masson、PAS）。 阅读提示：Methods: Histopathologic analysis |
| 流式细胞术 | 肺和脾脏单细胞制备、抗体组合和浓度、破膜固定步骤、上机仪器型号。 阅读提示：Methods: Tissue staining and flow cytometry |