药物库构建与化学型分类
收集具有潜在半胱氨酸反应性的临床药物，并按其反应机制进行分类。
从DrugBank中选取70种DPCCs，包括66种药品、2种营养品和2种化妆品，并根据其潜在反应机制分为亲核加成、亲核取代和氧化三类。
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具有不同半胱氨酸反应性化学型的药物的蛋白质组配体能力图谱
Proteome-wide ligandability maps of drugs with diverse cysteine-reactive chemotypes.
实验完整度
高包含体外QTRP筛选、细胞水平验证、功能验证（JAK1、NCOA4）、机制研究（PROTAC降解）以及体内外模型（细胞系）等多层级实验。
主要模型
HEK293T细胞 HT1080细胞
重点核对
QTRP实验中药物处理浓度（5 μM 和 20 μM）及处理时间（2 h） 药物竞争实验中的IPM探针浓度（100 μM） JAK1 C988S突变体验证natamycin靶向特异性 NCOA4 C244S突变体验证DPCCs靶向特异性 EtA-(S)-JQ1处理浓度（100 nM）及时间（4 h）
摘要
共价药物发现自2013年首个靶向半胱氨酸的激酶抑制剂获批以来经历了复兴。许多偶然发现的药物也具有与半胱氨酸残基反应的能力，从而导致与多种蛋白质的相互作用。这种广泛的相互作用，称为多向药理学，促使我们需要全面研究这些药物如何与整个蛋白质组中的半胱氨酸结合。在此，我们报告了一项大规模分析，通过定义天然生物系统中70种药物的蛋白质组范围内半胱氨酸配体能力图谱来满足这一需求。我们检测了人类蛋白质组中超过24,000个半胱氨酸，确定了279个跨多种功能类别的潜在药物靶蛋白。我们进一步验证了几个半胱氨酸结合事件，在既有药物靶点和通常难以用小分子靶向的蛋白质上发现了此前未知的半胱氨酸位点。此外，我们的发现强调了利用药物-半胱氨酸相互作用进行靶向蛋白质降解的机会。总之，我们的分析为推进共价药物的开发提供了宝贵的资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探索具有半胱氨酸反应性化学型的临床药物在蛋白质组范围内的半胱氨酸配体能力，并验证其新的靶点和应用潜力。
- 核心机制
- 药物通过共价结合半胱氨酸残基（如JAK1 C988、NCOA4 C244、HECTD1 C1368）发挥功能，包括变构调节、破坏蛋白质-蛋白质相互作用以及作为E3连接酶招募剂用于靶向蛋白质降解。
- 主要证据
- QTRP筛选鉴定279个高置信度靶点半胱氨酸；通过Western blot、免疫沉淀、突变体实验和PROTAC降解实验验证了JAK1、NCOA4和HECTD1的具体相互作用。
- 研究意义
- 提供了一个全面的药物-半胱氨酸相互作用资源，有助于发现新的变构位点、内在无序区域和蛋白质-蛋白质相互作用界面，并支持药物重定位和PROTAC开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外QTRP筛选
评估每种药物对半胱氨酸组的整体反应性。
使用HEK293T细胞裂解液，药物（5 μM）或DMSO预处理2小时后，加入IPM探针标记半胱氨酸，通过CuAAC连接生物素标签，链霉亲和素富集后进行LC-MS/MS分析。每种药物重复筛选两次。
细胞水平QTRP筛选
在完整细胞中验证高反应性药物的靶点，提高覆盖深度。
对四种高反应性药物（etacrynic acid、dimethyl fumarate、parthenolide、natamycin）进行细胞水平QTRP，药物浓度20 μM处理2小时后裂解，加入IPM探针，并结合高pH分级提高鉴定深度。
靶点验证
验证QTRP发现的药物-半胱氨酸相互作用。
通过突变体实验（C988S）、竞争实验、合成探针（Natamycin-Alkyne）和免疫沉淀等方法验证JAK1、NCOA4和HECTD1的相互作用。
功能验证
探究药物-半胱氨酸相互作用对蛋白功能和细胞过程的影响。
通过Western blot检测信号通路蛋白磷酸化、FTH1表达、脂质过氧化和铁离子水平，以及MTT实验评估细胞存活率，验证DPCCs对JAK1-STAT通路和NCOA4-FTH1轴的影响。
PROTAC开发
利用发现的E3连接酶相互作用开发靶向蛋白质降解策略。
合成EtA-(S)-JQ1 PROTAC，通过Western blot和定量蛋白质组学验证其诱导BRD4降解的能力，并通过对照化合物和敲低实验验证其作用机制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| QTRP实验 | IPM (2-碘-N-(丙-2-炔-1-基)乙酰胺) | KeraFast | EVU111 |
| 轻标叠氮-UV-生物素 | KeraFast | EVU102 | |
| 重标叠氮-UV-生物素 | KeraFast | EVU151 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| MEM培养基 | Procell | -- | |
| 药物处理 | 纳他霉素 | -- | -- |
| 小白菊内酯 | -- | -- | |
| 依他尼酸 | -- | -- | |
| 富马酸二甲酯 | -- | -- | |
| 免疫印迹 | 抗JAK1抗体 | Proteintech | 66466-1-Ig |
| 抗磷酸化JAK1 (Tyr1034/1035)抗体 | CST | 3331S | |
| 抗磷酸化Stat6 (Tyr641)抗体 | CST | 56554S | |
| 抗FTH1抗体 | ABclonal | A19544 | |
| 抗NCOA4抗体 | ABclonal | A25307 | |
| 抗BRD4抗体 | Abcam | ab128874 | |
| 抗HECTD1抗体 | Proteintech | 20605-1-AP | |
| 免疫沉淀 | 链霉亲和素琼脂糖珠 | GE | 17-5113-01 |
| 抗Flag M2亲和凝胶 | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| 体外激酶实验 | ADP-Glo™激酶检测试剂盒 | Promega | V6930 |
| PhosphoSens®蛋白激酶检测 | AssayQuant Technologies Inc. | CSKS-AQT0663K | |
| 荧光检测 | FerroOrange荧光探针 | Dojindo | F374 |
| BODIPY-C11荧光探针 | Invitrogen | D3861 | |
| 药物处理 | 托法替布 | Targetmol | T6321 |
| 甲磺酸去铁胺 | Targetmol | T1637 | |
| 细胞培养 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| ExFect转染试剂 | Vazyme | T101-01 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外QTRP筛选 | 药物处理浓度（5 μM）、处理时间（2 h）、IPM探针浓度（100 μM）、重复次数（2次） 阅读提示：Methods: Compound treatment, QTRP实验部分 |
| 细胞水平QTRP筛选 | 药物处理浓度（20 μM）、处理时间（2 h）、IPM探针浓度（100 μM）、重复次数（3次） 阅读提示：Methods: Compound treatment, QTRP实验部分 |
| 靶点验证 | 突变体（C988S、C244S、C1368S）、药物处理浓度（20 μM）、处理时间（4 h）、IPM探针浓度（100 μM） 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation, Western blotting |
| PROTAC降解实验 | EtA-(S)-JQ1浓度（100 nM）、处理时间（4 h）、对照药物（JQ1, 11, 12）浓度（5 μM） 阅读提示：Methods: Compound treatment, Western blotting |