热应激模型建立
建立不同热应激程度的扇贝心脏模型,以研究心脏对高温的反应。
将150个扇贝从22℃逐渐升温至34℃,分三组:正常心率组(NG,22.1℃)、最大心率组(MG,31.9℃)、心率下降组(DG,33℃),每组3个心脏混合为1个样本用于后续分析。
Single-cell transcriptomic dynamics of scallop heart reveals the heterogeneous response to heat stress.
整合了形态学(SEM/TEM)、生理代谢、scRNA-seq、细胞通讯、拟时序分析、RNAi敲低和过表达等多层实验证据。
海湾扇贝(Argopecten irradians)心脏组织 H9C2小鼠心肌细胞系
热应激分组:NG(22.1℃)、MG(31.9℃)、DG(33℃),每组样本数n=4 scRNA-seq样本:NG、MG、DG各1个混合样本(3个心脏混合),共84,925个细胞,过滤后50,048个 siRNA敲低实验:60个扇贝分为NIG、PIG、SIG三组,每组20个,注射20μl(20μM)siRNA ABT测定:SIG相比NIG和PIG显著降低约2.13℃和1.93℃ H9C2细胞过表达:2ng质粒转染,n=3,TG含量降低
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
建立不同热应激程度的扇贝心脏模型,以研究心脏对高温的反应。
将150个扇贝从22℃逐渐升温至34℃,分三组:正常心率组(NG,22.1℃)、最大心率组(MG,31.9℃)、心率下降组(DG,33℃),每组3个心脏混合为1个样本用于后续分析。
评估热应激对心脏结构损伤和神经体液、代谢变化的影响。
使用SEM和TEM观察心脏超微结构;检测神经递质(NE、ACh、GABA)及AChE活性;检测能量代谢酶(PDH、LDH、PK)和ROS含量。
表征扇贝心脏在热应激下的细胞组成和异质性反应。
对NG、MG、DG组心脏进行scRNA-seq,通过UMAP聚类识别细胞类型,分析各细胞簇的差异表达基因。
探究热应激下心肌细胞与其他细胞间的通讯变化及心肌细胞分化潜力。
使用CellphoneDB分析细胞间配体-受体相互作用,使用Monocle进行拟时序分析。
验证AiPLRP2-like对扇贝心脏耐热性和脂质代谢的调控作用。
通过siRNA敲低和过表达实验,检测心率、ABT和甘油三酯含量变化。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 心脏功能监测 | CNY-70红外传感器 | -- | -- |
| Powerlab数据采集系统 | ADInstruments | 16/35 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | MLBIO | ML095490 |
| 神经递质检测 | ELISA试剂盒 | MLBIO | YJ120412 |
| ELISA试剂盒 | MLBIO | YJ970288 | |
| ELISA试剂盒 | MLBIO | YJ095510 | |
| 酶活性检测 | AChE活性试剂盒 | Jiancheng | A024-1 |
| 代谢产物检测 | ATP检测试剂盒 | Jiancheng | A095-1 |
| ROS检测试剂盒 | Jiancheng | E004-1 | |
| 酶活性检测 | LDH活性试剂盒 | Jiancheng | A020-2 |
| PK活性试剂盒 | Jiancheng | A076-1 | |
| PDH活性试剂盒 | Solarbio | BC0385 | |
| 电镜固定 | 电镜固定液 | Servicebio | G1102 |
| 扫描电镜 | SU8100扫描电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 透射电镜 | HT7700透射电子显微镜 | Hitachi | -- |
| 线粒体染色 | Mito-Tracker Green染料 | Beyotime Biotechnology | C1048 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Beyotime Biotechnology | C2003S |
| 流式分析 | BD FACSAria III流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 单细胞测序 | Chromium单细胞3'试剂盒 | 10x Genomics | v3.1 |
| 文库质控 | 高灵敏度DNA芯片 | Agilent | -- |
| Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| 文库定量 | Qubit高灵敏度DNA检测 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 测序 | NovaSeq6000测序仪 | Illumina | -- |
| 基因克隆 | ClonExpress II一步克隆试剂盒 | Vazyme | C112 |
| 质粒转化 | DH5α感受态细胞 | Biotechnology Technologies | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Solarbio | 11995 |
| 胎牛血清 | Hyclone | SV30208 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 甘油三酯检测 | 甘油三酯检测试剂盒 | Jiancheng | A110-1 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 热应激实验 | 温度、升温速率、分组条件、样本量 阅读提示:Methods: Scallop culture and heat exposure experiment |
| 神经递质和代谢检测 | 试剂盒型号、样本处理、检测波长 阅读提示:Methods: Physiological indices in heart under heat exposure |
| 电镜观察 | 固定条件、脱水、包埋、切片厚度 阅读提示:Methods: Microscopic examination of heart |
| 线粒体评估 | 染料浓度、孵育时间、流式细胞仪设置 阅读提示:Methods: Evaluation of mitochondrial quality and quantity under heat exposure |
| scRNA-seq | 消化条件、细胞活性、文库制备、测序平台 阅读提示:Methods: ScRNA-seq library preparation and sequencing |
| scRNA-seq数据分析 | 比对参数、质控标准、聚类参数 阅读提示:Methods: Initial processing of scRNA-seq data |
| RNA干扰 | siRNA序列、注射剂量、分组、测量时间 阅读提示:Methods: AiPLRP2-like knockdown effects on cardiac performance |
| 过表达实验 | 细胞系、转染量、培养条件、检测时间 阅读提示:Methods: AiPLRP2-like overexpression effects on triglyceride content |