TAD的结构表征
解析YAP/TAZ TAD的结构特征及其对转录激活的作用
通过序列比对和Gal4-UAS荧光素酶报告实验评估TAD活性，利用NMR解析TAD溶液结构，并验证疏水残基对转录活性的影响。
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YAP/TAZ转录激活的机制及癌症治疗的双靶向策略
The mechanism of YAP/TAZ transactivation and dual targeting for cancer therapy.
实验完整度
高包含体外细胞实验、NMR结构解析、小鼠同种移植瘤模型、患者来源细胞和类器官等多个证据层级，并进行功能验证（TAD敲除）和机制验证（蛋白互作和转录调控）。
主要模型
KrasLSLG12D;Trp53f/f小鼠肺肿瘤来源细胞系（TDCL） 人肺腺癌细胞系NCI-H1299 患者来源的原代肺腺癌细胞和类器官 C57BL/6J小鼠同种移植瘤模型
重点核对
YAP/TAZ TAD敲除对肿瘤生长和免疫浸润的影响（体内实验） TAD与TAF4/MED15相互作用的验证方法（Co-IP、NMR滴定、SPR） 合成的肽TJ-M11的浓度、处理时间和给药方式 用于转录分析的细胞系和基因（如CTGF、CYR61、CSF1、IL33）
摘要
转录共激活因子Yes相关蛋白（YAP）和具有PDZ结合基序的转录共激活因子（TAZ）通过转录输出在癌症中发挥关键作用。然而，它们的转录激活机制仍不清楚，且缺乏有效的靶向策略。在此，我们表明YAP/TAZ具有一个疏水性转录激活结构域（TAD）。TAD敲除由于生长缺陷而阻止肿瘤建立，并增强免疫攻击。机制上，TAD通过招募TATA结合蛋白相关因子4（TAF4）依赖性TFIID复合物促进预起始复合物（PIC）组装，并通过中介复合物亚基15（MED15）依赖性中介复合物招募增强RNA聚合酶II（Pol II）延伸，以表达致癌/免疫抑制程序。合成的肽TJ-M11选择性地破坏TAD与MED15和TAF4的相互作用，抑制肿瘤生长并使肿瘤对免疫治疗敏感。我们的发现表明，YAP/TAZ TAD通过疏水相互作用在PIC组装和Pol II延伸中发挥双重功能，代表了癌症治疗和联合免疫治疗的可操作靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- YAP/TAZ的转录激活结构域如何调控转录，以及能否作为癌症治疗的靶点？
- 核心机制
- YAP/TAZ TAD通过疏水相互作用分别招募TAF4和MED15，促进PIC组装和Pol II延伸，从而驱动致癌和免疫抑制基因表达；TAD与MED15的相互作用还增强转录凝聚。
- 主要证据
- NMR结构解析鉴定TAD的疏水特征；Co-IP和NMR滴定验证TAD与TAF4和MED15的直接互作；CUT&Tag显示TAF4和MED15敲低影响Pol II占用；TAD敲除和TJ-M11处理抑制肿瘤生长并增强免疫。
- 研究意义
- 靶向YAP/TAZ TAD与共激活因子的相互作用（尤其是FLTWL基序）为癌症治疗和联合免疫治疗提供了潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TAD功能验证（体外和体内）
评估TAD对肿瘤生长和免疫微环境的作用
在TDCL细胞中敲除YAP TAD（TAZ-/-背景），通过平板克隆和同种移植瘤实验观察肿瘤生长；在免疫缺陷小鼠中比较肿瘤大小；检测肿瘤浸润CD8+ T细胞和M2巨噬细胞；通过RNA-seq鉴定下游靶基因。
机制解析：TAD与TAF4相互作用
阐明TAD如何通过TAF4促进PIC组装和Pol II装载
通过BioID和Co-IP验证YAP与TAF4相互作用；NMR滴定确定结合界面（TAFH结构域）；CUT&Tag分析TAF4敲低对Pol II占用的影响；RT-qPCR检测靶基因表达。
机制解析：TAD与MED15相互作用
阐明TAD如何通过MED15促进Pol II延伸
通过Co-IP验证YAP与MED15相互作用；NMR和SPR确定结合界面（ABD3域）；CUT&Tag分析MED15敲低对Pol II延伸的影响；RT-qPCR检测新生RNA与mRNA比值；体内移植瘤实验评估MED15敲除对肿瘤生长的影响。
转录凝聚形成
验证TAD与MED15的疏水相互作用促进转录凝聚形成
通过共表达实验和体外液滴实验观察YAP和MED15的共凝聚；使用荧光显微镜监测转录活性。
靶向TAD的肽抑制剂验证
开发并验证靶向TAD相互作用的肽抑制剂的抗肿瘤效果
合成模拟FLTWL基序的肽（如TJ-M11），体外检测其对YAP靶基因和细胞增殖的影响；体内评估单药和联合抗PD-1的抗肿瘤效果；使用患者来源细胞和类器官验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 抗体 | 抗Flag抗体（M2） | Sigma-Aldrich | F3165 |
| 抗HA标签抗体（C29F4） | Cell Signaling | 3724 | |
| 抗YAP1抗体 | Cell Signaling | 14074 | |
| 抗TAZ抗体（V386） | Cell Signaling | 4833 | |
| 抗TAZ抗体 | Cell Signaling | 83669 | |
| 抗MED15抗体 | Proteintech | 11566-1-AP | |
| 抗TAF4抗体 | Biodragon | BD-PT4527 | |
| 抗SPT5抗体 | ABclonal | A19225 | |
| 抗PAF1抗体 | ABclonal | A3437 | |
| 抗CDK9抗体 | ABclonal | A11145 | |
| 免疫共沉淀 | Western-IP裂解液 | Beyotime | P0013 |
| Protein G琼脂糖珠 | Millipore | 16-226 | |
| 流式分析 | 胶原酶IV | Invitrogen | 17104019 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | 10104159001 | |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| 可固定活力染料-eFluor 506 | eBioscience | 65-0866-14 | |
| CD45-percp/Cy5.5抗体 | BioLegend | Clone | |
| 抗CD3-APC抗体 | BioLegend | Clone | |
| 抗CD8a-PE/Cy7抗体 | BioLegend | Clone | |
| 固定/透化溶液 | BioLegend | 420801 | |
| 透化/洗涤缓冲液 | BioLegend | 421002 | |
| 抗IFNγ-Bv421抗体 | BioLegend | Clone | |
| 抗GZMB-FITC抗体 | BioLegend | Clone | |
| Flex-T生物素H-2Kb/OVA (257-264)四聚体 | BioLegend | 280051 | |
| 类器官培养 | TrypLE Express消化液 | -- | -- |
| 基质胶 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂 | Promega | G9681 |
| 类器官培养 | 96孔白板 | Corning | -- |
| RNA提取 | RNA提取试剂 | Vazyme Biotech | RC112-01 |
| RT-qPCR | HiScript II逆转录酶 | ABclonal | RK20428 |
| SYBR Green PCR预混液 | ABclonal | RM21203 | |
| RNAprep纯化试剂盒 | TIANGEN | DP430 | |
| cDNA逆转录试剂盒 | ABclonal | RK20400 | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Vazyme | -- | |
| CUT&Tag | 抗RNA聚合酶II CTD重复YSPTSPS抗体 | Abcam | ab817 |
| 正常小鼠IgG | ABclonal | AC011 | |
| 山羊抗小鼠IgG H&L | Abcam | ab6708 | |
| 亚精胺 | Vazyme | TD903 | |
| TruePrep Index Kit V2（Illumina） | Vazyme | TD202 | |
| 免疫荧光 | 抗TTF-1抗体 | ZSGB-Bio | ZM-0270 |
| 抗E-钙粘蛋白抗体 | Invitrogen | 13-1900 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | Ni-NTA树脂 | Qiagen | 30210 |
| 咪唑 | Sigma | 792527 | |
| Hiload 16/600 200 pg凝胶过滤柱 | GE | GE28-9893-35 | |
| Cy3荧光染料 | MCE | HY-D0822 | |
| PD-10脱盐柱 | GE | GE17-0853-02 | |
| Amicon Ultra-15离心过滤器 | Millipore | -- | |
| 动物实验 | 抗小鼠CD8α抗体 | BioXCell | BE0061 |
| 抗PD-1抗体 | Selleck | A2122 | |
| 转染 | Lipofectamine RNAi-MAX转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- | |
| 聚凝胺 | Yeasen | -- | |
| 仪器 | FACSVerse流式细胞仪 | BD | -- |
| Avance III 600 MHz核磁共振波谱仪 | Bruker | -- | |
| Biacore T200系统 | Cytiva | -- | |
| Q Exactive Plus质谱仪 | -- | -- | |
| EASY-nLC 1200液相色谱系统 | -- | -- | |
| 2100 Expert生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Nanodrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- | |
| Olympus FV3000共聚焦系统 | Olympus | -- | |
| 蛋白质标记 | His-MED15-CY3荧光标记蛋白 | -- | -- |
| His-YAP-mEGFP荧光标记蛋白 | -- | -- | |
| 肽合成 | Fmoc保护的氨基酸 | -- | -- |
| HBTU缩合试剂 | -- | -- | |
| 异硫氰酸荧光素 | -- | -- | |
| 细胞培养 | 杀稻瘟菌素 | InvivoGene | ant-bl-05 |
| 质粒构建 | pET22b载体 | -- | -- |
| pET30a载体 | -- | -- | |
| pFAST bacmid | -- | -- | |
| lentiCRISPRv2载体 | Addgene | 52961 | |
| pL-CRISPR.EFS.tRFP载体 | Addgene | 57819 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包装质粒 | Addgene | 12259 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系使用的培养基（DMEM或RPMI 1640）和添加剂（FBS、青霉素/链霉素） 阅读提示：Methods: Cell lines |
| TAD活性测定 | Gal4-UAS-luciferase报告质粒用量和转染时间 阅读提示：Methods: UAS-Luc transcription assay |
| TAD敲除实验 | TDCL细胞中YAP TAD敲除方法（CRISPR-Cas9）和细胞系背景（TAZ-/-） 阅读提示：Methods: Generation of knockout cell lines with CRISPR-Cas9; Figure 2 |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6J或NCG）、细胞注射数量、肿瘤体积计算方式 阅读提示：Methods: Tumor model |
| 蛋白相互作用分析 | NMR滴定中的蛋白浓度和摩尔比 阅读提示：Methods: NMR data collection, structure determination, relaxation and titration experiments |
| CUT&Tag实验 | 细胞数量、抗体使用量、片段化条件、测序平台 阅读提示：Methods: CUT & Tag experiments |
| 肽处理实验 | TJ-M11的浓度和处理时间（如4μM 48h） 阅读提示：Figure 7f; Methods: Cell viability and colony formation assay |
| 免疫治疗联合实验 | TJ-M11给药剂量（5 mg/kg）和频率、抗PD-1抗体剂量（200 μg）和频率 阅读提示：Methods: Tumor model; Figure 7i |