ATG基因敲低筛选
确定哪些自噬相关基因影响立克次体与宿主细胞的结合。
在H1299细胞中敲低ATG4A、ATG5、ATG7、ATG10、ATG16L1和ATG9A，检测自噬标志物并感染立克次体，定量黏附。
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ATG9通过阻断rOmpB-XRCC6/KU70相互作用抑制立克次体与宿主细胞表面的结合
ATG9 inhibits Rickettsia binding to the host cell surface by blocking the rOmpB-XRCC6/KU70 interaction.
实验完整度
高包含细胞系敲低实验、免疫共沉淀、亲和分离、分子对接、体内小鼠模型等至少两个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
H1299细胞 HEK293细胞 rOmpB-E. coli模型 C57BL/6J小鼠模型
重点核对
ATG9A KD 显著增加立克次体黏附，其他ATG KD无影响 ATG9与XRCC6的结合需要第二和第五胞质基序 XRCC6的DNA结合域是ATG9和rOmpB的共同结合位点 ATG9A或ATG9B表达阻断rOmpB与XRCC6结合 雷帕霉素处理增加ATG9表达并减少小鼠肝脏中rOmpB-E. coli菌落数
摘要
立克次体是通过蜱传播的病原体，其感染人类宿主的机制尚不清楚。本文报道了ATG9（自噬相关蛋白9）在抑制立克次体与宿主细胞表面结合中发挥的先前未被认识的作用。出人意料的是，ATG9的这一新功能可能不依赖于巨自噬/自噬。相反，ATG9作为一种宿主防御因子，通过结合XRCC6/KU70（立克次体外膜蛋白rOmpB的受体）发挥作用。ATG9和rOmpB均与XRCC6的DNA结合域结合，提示ATG9可能竞争性占据rOmpB的结合位点，从而消除立克次体的结合。此外，我们证明雷帕霉素在转录水平激活ATG9，并在小鼠模型中抑制rOmpB介导的感染。总之，我们的研究揭示了一种调控立克次体感染的新型先天机制，并提示ATG9激动剂可能有助于制定干预立克次体疾病的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ATG9如何调控立克次体与宿主细胞表面的结合？其机制是否依赖自噬？
- 核心机制
- ATG9通过其第二和第五胞质基序与XRCC6的DNA结合域结合，占据rOmpB的结合位点，从而竞争性阻断rOmpB与XRCC6的相互作用，抑制立克次体黏附，此过程不依赖自噬活性。
- 主要证据
- ATG9A或ATG9B敲低增加立克次体结合，其他ATG敲低无影响；自噬抑制剂不影响感染；免疫共沉淀、亲和分离和分子对接证明ATG9与rOmpB竞争结合XRCC6的DNA结合域；雷帕霉素诱导ATG9表达并抑制小鼠模型中rOmpB介导的感染。
- 研究意义
- 揭示了宿主抵抗立克次体感染的新型先天机制，并提示ATG9激动剂可能作为干预立克次体疾病的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
自噬抑制剂处理
验证ATG9对立克次体结合的作用是否依赖自噬。
用氯喹（CQ）和巴弗洛霉素A1（BafA1）处理H1299细胞，检测自噬标志物和立克次体感染。
鉴定ATG9相互作用蛋白
寻找ATG9A和ATG9B的结合蛋白，以阐明机制。
通过IP-MS鉴定ATG9A和ATG9B结合蛋白，KEGG通路分析发现XRCC6和XRCC5。通过IP-western blot和免疫荧光共定位验证。
ATG9与rOmpB竞争结合XRCC6
证明ATG9通过占据rOmpB结合位点抑制立克次体黏附。
构建XRCC6缺失突变体，进行IP和亲和分离实验，验证ATG9和rOmpB均结合DNA结合域；表达ATG9阻断rOmpB与XRCC6结合；体外GST亲和分离验证直接竞争。
雷帕霉素调控ATG9表达及体内感染
评估雷帕霉素通过诱导ATG9抑制rOmpB介导感染的能力。
用雷帕霉素处理H1299细胞，检测ATG9A/B表达和MTOR活性；荧光素酶报告基因验证TFEB激活ATG9B启动子；小鼠尾静脉注射rOmpB-E. coli并用雷帕霉素处理，检测肝脏细菌载量和IHC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因敲低和细胞培养
分子结合分析
体内实验
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blotting | ACTB/β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| ATG4A抗体 | CST | 7613 | |
| ATG5抗体 | CST | 2630 | |
| ATG7抗体 | CST | 8558 | |
| ATG10抗体 | Abcam | Ab124711 | |
| Western blotting and immunofluorescence | ATG9A抗体 | CST | 13509 |
| ATG9B抗体 | Invitrogen | PA5-78672 | |
| Western blotting | ATG16L1抗体 | CST | 8089 |
| LC3A/B抗体 | CST | 12741 | |
| SQSTM1/p62抗体 | Abcam | ab109012 | |
| Western blotting, immunoprecipitation | His抗体 | Invitrogen | MA1-21315 |
| MYC抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| Western blotting | Tubulin抗体 | Proteintech | 11224-1-AP |
| XRCC6抗体 | Proteintech | 66607-1-Ig | |
| p-RPS6/S6抗体 | CST | 2211 | |
| Immunofluorescence | 鬼笔环肽追踪红555 | Beyotime | C2203S |
| 抗大肠杆菌抗体 | Abcam | ab137967 | |
| Alexa Fluor 647染料 | Abcam | ab150079 | |
| Alexa Fluor Plus 488染料 | Invitrogen | A32731 | |
| ATG9A抗体 | Abcam | ab108338 | |
| XRCC6抗体 | Invitrogen | MA5-31598 | |
| Western blotting | 聚偏二氟乙烯膜 | Millipore | IPVH00010 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | APExBIO | K1007 | |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | APExBIO | K1015 | |
| Transfection | 聚乙烯亚胺 | Suolaibao Biotech | E8420 |
| 聚凝胺 | Suolaibao Biotech | H8761 | |
| PL转染试剂 | Quanshijin Biotech | FT301-01 | |
| Cell culture | Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985062 |
| Western blotting | ECL底物 | NCM Biotech | P2300 |
| RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C | |
| SDS-PAGE上样缓冲液 | Beyotime | P0015 | |
| Cell staining | 结晶紫 | Beyotime | C0121 |
| Immunofluorescence | 鬼笔环肽iFluor | Yeasen Biotechnology | 40737ES75 |
| Drug treatment | 氯喹 | Merck | C-271 |
| 巴弗洛霉素A1 | Merck | 5084090001 | |
| Cell culture | RPMI-1640培养基 | Procell | PM150110 |
| DMEM培养基 | Procell | PM150210 | |
| Construct generation | ATG9A cDNA | Addgene | 60609 |
| ATG9B cDNA | Origene | MR217776 | |
| pCMV10-3×FLAG载体 | Youbio | VT1070 | |
| pcDNA3.1载体 | Thermo Scientific | V79520 | |
| pGL3-basic载体 | Promega | E1741 | |
| Mutagenesis | Q5定点突变试剂盒 | New England BioLabs | E0554s |
| Transfection | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Scientific | 11668019 |
| Western blotting | TBS-T缓冲液 | Beyotime | ST677 |
| HRP偶联二抗 | Proteintech | SA00001-1 | |
| Immunoprecipitation | Protein G磁珠 | Invitrogen | 10004D |
| IgG | Proteintech | B900620 | |
| DNA extraction | 血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒 | Tiangen Bio | DP304-02 |
| Protein expression | pET-22b载体 | Qiyunbio | QP1140 |
| 异丙基硫代半乳糖苷 | Beyotime | ST098 | |
| Protein purification | Ni-NTA琼脂糖 | Beyotime | P2226 |
| Antibody production | 完全弗氏佐剂 | Thermo Scientific | 77140 |
| 不完全弗氏佐剂 | Thermo Scientific | 77145 | |
| Cell culture | 磷酸盐缓冲液 | Beyotime | C0221A |
| Rickettsia preparation | 玻璃珠 | Beyotime | ST3389 |
| 蔗糖 | Solarbio | S8271 | |
| 磷酸二氢钾 | Solarbio | P7392 | |
| 磷酸氢二钾 | Solarbio | D8490 | |
| 谷氨酰胺 | Solarbio | G0200 | |
| 氯化镁 | Solarbio | M8161 | |
| Microscopy | Triton X-100 | Beyotime | P0096 |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| 卡尔·蔡司LSM880共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM880 | |
| 卡尔·蔡司LSM980共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | LSM980 | |
| 1400 TEM透射电子显微镜 | JEOL | 1400 | |
| 体积扫描电子显微镜 | FEI | -- | |
| Animal experiments | 雷帕霉素 | Medchemexpress | HY-10219 |
| Statistical analysis | GraphPad Prism 8.4软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与基因敲低 | H1299细胞来源，ATG9A和ATG9B敲低的sgRNA序列，敲低效率验证 阅读提示：Materials and methods: Cell culture, Transfection; Figure 1 legend |
| 立克次体感染实验 | Rickettsia heilongjiangensis B8株来源，感染MOI=50，感染时间1小时，感染定量方法（RT-PCR检测rOmpB） 阅读提示：Materials and methods: Rickettsia preparation and infection; Figure 1 legend |
| 蛋白相互作用验证 | IP-MS鉴定ATG9A和ATG9B结合蛋白，KEGG通路分析，免疫共沉淀和亲和分离条件 阅读提示：Materials and methods: Western blotting and immunoprecipitation; Figure 2 legend |
| 竞争结合分析 | XRCC6的DNA结合域缺失突变体对结合的影响，ATG9A或ATG9B过表达对rOmpB-XRCC6结合的抑制 阅读提示：Materials and methods: Constructs; Figure 6 and 7 legends |
| 雷帕霉素处理 | 雷帕霉素浓度（100 μM）和处理时间（24小时），ATG9B启动子报告基因实验，小鼠给药剂量50 mg/kg 阅读提示：Materials and methods: Animal experiments; Figure 8 legend |