dsRBP鉴定（PISA）
高通量鉴定与dsRNA结合后溶解度改变的蛋白质。
使用PISA-DIA工作流，HeLa细胞裂解液与poly(I:C)孵育，加热至不同温度，分离可溶部分，LC-MS/MS定量，比较poly(I:C)处理与对照的蛋白质溶解度变化。
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通过溶解度分析表征双链RNA结合蛋白，鉴定ZNF385A为双链RNA稳态调节因子
Characterization of dsRNA binding proteins through solubility analysis identifies ZNF385A as a dsRNA homeostasis regulator.
实验完整度
高包含PISA筛选、CETSA和pull-down验证、CRISPR敲除功能实验、dsRIP-seq机制探究及NK细胞功能实验等独立证据层级。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 ASPC1细胞 BEAS.2B细胞
重点核对
ZNF385A敲除细胞系（HeLa、HEK293T、ASPC1） poly(I:C)处理浓度10 μg/mL及温度梯度45-56°C CRISPR/Cas9 sgRNA靶向序列 5-AZA-CdR处理浓度0.3 μM处理24小时 NK92细胞杀伤实验效应靶比1:2或1:5
摘要
双链RNA（dsRNA）结合蛋白（dsRBPs）在各种细胞过程中，特别是在先天免疫应答中，发挥着关键作用。全面表征dsRBPs对于理解dsRNA感知和反应的复杂机制至关重要。传统方法主要依赖于亲和纯化，倾向于分离强dsRNA结合蛋白。在这里，我们采用蛋白质组整合溶解度改变（PISA）工作流程来表征dsRBPs，观察到18种已知的dsRBPs，并鉴定出200种潜在的dsRBPs。接下来，我们聚焦于锌指蛋白385A（ZNF385A），发现其敲除在缺乏免疫原性刺激的情况下激活了干扰素-β的转录。ZNF385A的敲除升高了内源性dsRNA的水平，特别是与反转录转座子相关的转录本，如短散在核元件（SINE）、长散在核元件（LINE）和长末端重复序列（LTR）。此外，ZNF385A的缺失增强了5-Aza-2’-脱氧胞苷（5-AZA-CdR）的生物活性和NK细胞的肿瘤杀伤效果。我们的发现极大地扩展了dsRBP库，并有助于理解细胞dsRNA稳态。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何全面表征dsRNA结合蛋白，并探索新鉴定的dsRBP在dsRNA稳态和先天免疫中的功能？
- 核心机制
- ZNF385A通过其锌指结构域结合dsRNA，并通过与RNA剪接相关蛋白（如PTBP1和TARDBP）相互作用，调节RNA剪接，防止含有反转录转座子的内含子保留，从而维持dsRNA稳态，抑制IFN-I信号通路。
- 主要证据
- PISA筛选鉴定218种潜在dsRBP；体外CETSA和pull-down验证ZNF385A结合dsRNA；ZNF385A敲除导致IFNβ和ISGs上调（RT-qPCR和Western blot），内源性dsRNA累积（J2 dot blot和免疫荧光），dsRIP-seq显示富集的dsRNA主要来自SINE、LINE、LTR并定位于内含子；TurboID和co-IP显示与剪接因子相互作用；5-AZA-CdR处理和NK杀伤实验显示功能协同。
- 研究意义
- 该研究扩展了dsRBP库，揭示了ZNF385A作为dsRNA稳态调节因子的新功能，并提出靶向ZNF385A联合5-AZA-CdR或NK细胞免疫治疗可能增强癌症治疗效果的潜在应用方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
候选dsRBP验证
验证PISA鉴定的潜在dsRBP的dsRNA结合能力。
使用CETSA检测蛋白热稳定性变化，使用poly(I:C) pull-down实验验证特异性结合，并使用AlphaFold3预测ZNF385A-dsRNA复合物结构，通过突变锌指结构域验证结合位点。
ZNF385A功能研究
探究ZNF385A对IFN-I信号和内源性dsRNA水平的影响。
通过CRISPR/Cas9敲除ZNF385A，检测IFNβ和ISG表达（RT-qPCR），检测dsRNA水平（dot blot、免疫荧光），通过dsRIP-seq分析dsRNA组成，通过TurboID和co-IP鉴定相互作用蛋白。
功能应用评估
评估ZNF385A缺失对5-AZA-CdR疗效和NK细胞杀伤的影响。
用5-AZA-CdR处理WT和KO细胞，检测IFNβ等表达；用NK92细胞杀伤实验（CCK8和Calcein-AM法）检测细胞毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证dsRNA结合
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| PISA实验 | 低分子量poly(I:C) | InvivoGen | -- |
| 生物素标记的poly(I:C) | InvivoGen | -- | |
| poly(dA:dT) | InvivoGen | -- | |
| pull-down实验 | poly(C) | Sigma | -- |
| poly(I) | Sigma | -- | |
| poly(C)琼脂糖 | Sigma | -- | |
| CNBr活化琼脂糖4B | Sigma | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| CRISPR敲除 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- |
| Western blot | GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| FLAG标签抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| PTBP1抗体 | Proteintech | 12582-1-AP | |
| TARDBP抗体 | Proteintech | 10782-2-AP | |
| ZNF385A抗体 | Proteintech | 26288-1-AP | |
| PRKRA抗体 | ABclonal | A8779 | |
| RIG-I抗体 | ABclonal | A3689 | |
| MDA5抗体 | ABclonal | A2419 | |
| STAU1抗体 | ABclonal | A4619 | |
| dsRNA检测 | 抗dsRNA J2抗体 | Scions | -- |
| J2免疫荧光 | RNase III | NEB | E6146 |
| Alexa Fluor 568标记山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| dsRIP | 蛋白G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| dsRIP-seq | rRNA去除试剂盒 | Vazyme | RN416 |
| 链特异性mRNA文库制备试剂盒 | Wuhan Seqhealth Co., Ltd. | -- | |
| DNBSEQ-T7测序平台 | MGI | -- | |
| 质谱分析 | Fusion Lumos质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Easy-nLC 1000纳升液相色谱 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| NK细胞杀伤实验 | CCK-8试剂盒 | GplBio | -- |
| Calcein AM | Beyotime | -- | |
| 细胞实验 | 5-氮杂-2'-脱氧胞苷 | -- | -- |
| IFNβ蛋白 | -- | -- | |
| RT-qPCR | FastQuant反转录试剂盒 | Sangon Biotech | -- |
| SYBR qPCR预混液 | Zoman | -- | |
| QuantStudio 1 Plus实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物片剂 | Roche Diagnostics | -- |
| 蛋白消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 二硫苏糖醇 | Sigma | -- | |
| 尿素 | Sigma | -- | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 滤器辅助样品制备 | Amicon Ultra-0.5超滤离心管 | Merck Millipore | -- |
| 质谱分析 | 甲醇 | Merck | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Scientific | -- |
| 氯仿 | -- | -- | |
| 基因组DNA提取 | TIANamp基因组DNA提取试剂盒 | TIANGEN | -- |
| PCR产物纯化 | 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 | Takara | -- |
| 细胞培养 | NK-92培养基 | Procell | -- |
| 白细胞介素-2 | Procell | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PISA实验 | HeLa细胞裂解液浓度1 mg/mL，poly(I:C)浓度10 μg/mL孵育30分钟，温度梯度45-56°C，四个生物学重复，统计阈值P<0.01且|log2FC|>0.58 阅读提示：Methods-PISA assay, Fig. 1, Fig. 2a |
| CETSA验证 | 温度范围37-67°C，加热3分钟，离心条件100,000×g 20分钟，三次独立实验 阅读提示：Methods-CETSA, Fig. 3 |
| ZNF385A敲除 | 两个sgRNA靶序列，细胞系HEK293T、HeLa、ASPC1、BEAS.2B，嘌呤霉素筛选浓度2 μg/mL 阅读提示：Methods-CRISPR/Cas9-based gene KO, Supplementary Table 1 |
| dsRNA检测 | J2抗体用量，免疫荧光固定和通透条件，RNase III处理4小时，图像采集和分析参数 阅读提示：Methods-dsRNA dot blotting, J2 immunofluorescence imaging, Fig. 6 |
| 5-AZA-CdR处理 | 5-AZA-CdR浓度0.3 μM处理24小时，DMSO对照 阅读提示：Methods-cell culture, Fig. 8a-c |
| NK细胞杀伤实验 | NK92细胞与靶细胞比例（CCK8为1:2，Calcein-AM为1:5），共培养时间24小时（CCK8）或12小时（Calcein-AM），IFNβ处理10 ng/mL 24小时 阅读提示：Methods-NK92 cell-mediated tumor cell killing assay, Fig. 8d-e |
| dsRIP-seq | 细胞数量3×10^7，J2抗体量5 μg，免疫沉淀时间，测序平台和读长，数据分析参数 阅读提示：Methods-dsRNA immunoprecipitation, dsRIP-seq library preparation and next-generation sequencing, Fig. 6g |