YBX1敲低细胞模型建立
验证shRNA介导的YBX1敲低效率
使用靶向Ybx1的shRNA慢病毒感染RASMCs,通过嘌呤霉素筛选稳定细胞系,并通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
YBX1 Modulates Intimal Hyperplasia by Regulating Expression and Alternative Splicing of Cell Cycle Associated Genes in RASMCs.
包含细胞实验(增殖、凋亡、迁移)、分子检测(RT-qPCR、Western blot、ELISA)及转录组和RIP-seq分析,但缺乏动物模型和体内验证。
大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs) HEK293T细胞(RIP-seq数据来源)
YBX1敲低效率(shRNA序列及转染MOI=300) 细胞增殖(CCK-8,24h),凋亡(Annexin V/PI),迁移(transwell,24h) DEGs分析阈值(p<0.05,fold change>1.5或<0.67) RASEs分析(FDR 5%) 关键基因(CCNB1、CCND1、TPM1)的RIP-qPCR验证
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证shRNA介导的YBX1敲低效率
使用靶向Ybx1的shRNA慢病毒感染RASMCs,通过嘌呤霉素筛选稳定细胞系,并通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
评估YBX1敲低对细胞增殖、凋亡、迁移及表型转化的影响
通过CCK-8检测细胞活力,Annexin V/PI流式凋亡检测,transwell迁移实验,ELISA检测IL10,Western blot检测Calponin和Myocardin。
鉴定YBX1调控的差异表达基因及其富集通路
提取RNA进行链特异性RNA-seq,比对到mRatBN7.2基因组,使用DESeq2筛选DEGs,并进行KEGG和GO富集分析。
鉴定YBX1调控的可变剪接事件及其功能
使用ABLas流程鉴定ASEs和RASEs,对RASGs进行GO富集分析,并通过RT-qPCR验证Rhoc的A5SS事件。
鉴定YBX1结合的RNA靶点,并整合DEGs和RASGs分析其调控机制
下载GSE159153 RIP-seq数据,重新分析峰,与RNA-seq的DEGs和RASGs取交集,并通过RIP-qPCR验证关键靶点(CCNB1、CCND1、TPM1)的结合。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Procell | CM-R076 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10091148 | |
| 青霉素-链霉素 | Hyclone | SV30010 | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 基因表达检测 | 逆转录试剂盒 | Vazyme | R323-01 |
| 热循环仪 | Bio-Rad | T100 | |
| 实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | QuantStudio 5 | |
| 蛋白质检测 | RIPA裂解液 | Proteintech | PR20001 |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | 4693116001 | |
| 蛋白上样缓冲液 | Solarbio | P1040 | |
| PVDF膜 | Millipore | ISEQ00010 | |
| YBX1抗体 | Abcam | ab239875 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-lg | |
| 二抗(抗兔) | Proteintech | SA00001-2 | |
| 二抗(抗小鼠) | ABclonal | AS003 | |
| 增强化学发光试剂 | Beyotime | P0018FM | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | MCE | HY-K0301 |
| 酶标仪 | BioTek | ELX800 | |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-Alexa Fluor647/PI细胞凋亡检测试剂盒 | YEASEN | 40304ES60 |
| 流式细胞仪 | BD | FACSCanto | |
| 细胞迁移检测 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 结晶紫 | Beyotime | C0121 | |
| 倒置显微镜 | Mshot | MF52-N | |
| RNA-seq | RQ1 DNase | Promega | M6101 |
| VAHTS通用V8 RNA-seq文库制备试剂盒 | Vazyme | NR605 | |
| VAHTS mRNA捕获磁珠 | Vazyme | N401 | |
| VAHTS RNA多重寡核苷酸Set 1 | Vazyme | N323 | |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| RIP-qPCR | RNA酶抑制剂 | Takara | 2313A |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Bimake | B14001 | |
| YBX1抗体 | Sigma | Y0396-200UL | |
| 对照IgG抗体 | ABclonal | AC005 | |
| 蛋白A/G磁珠 | Thermo Scientific | 26162 | |
| 蛋白酶K | Sangon Biotech | B600169-0002 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| YBX1敲低 | shRNA序列、MOI、嘌呤霉素筛选浓度和时间 阅读提示:Materials and Methods 2.1, 2.2 |
| 细胞功能检测 | CCK-8细胞接种密度、检测时间;凋亡检测试剂盒用量;transwell迁移时间、细胞数、FBS浓度 阅读提示:Materials and Methods 2.5, 2.6, 2.7 |
| 分子检测 | 抗体稀释比例、孵育时间;ELISA试剂盒来源 阅读提示:Materials and Methods 2.4, 2.8 |
| 转录组分析 | DEGs阈值、RASEs统计方法、数据库版本 阅读提示:Materials and Methods 2.11, 2.12 |
| RIP实验 | 抗体、磁珠用量、洗涤条件、RNA提取方法 阅读提示:Materials and Methods 2.14 |