YBX1通过调节RASMCs中细胞周期相关基因的表达和可变剪接调节内膜增生

YBX1 Modulates Intimal Hyperplasia by Regulating Expression and Alternative Splicing of Cell Cycle Associated Genes in RASMCs.

作者信息Yi Huang, Yuheng Wang, Feng Zhu, Chao Guo, Xinyang Zhang, Yiqing Li, Yunfei Chen, Chuanqi Cai, Dan Shang
PMID40045484
发布时间2025-03
DOI10.1111/jcmm.70445

实验完整度

包含细胞实验(增殖、凋亡、迁移)、分子检测(RT-qPCR、Western blot、ELISA)及转录组和RIP-seq分析,但缺乏动物模型和体内验证。

主要模型

大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs) HEK293T细胞(RIP-seq数据来源)

重点核对

YBX1敲低效率(shRNA序列及转染MOI=300) 细胞增殖(CCK-8,24h),凋亡(Annexin V/PI),迁移(transwell,24h) DEGs分析阈值(p<0.05,fold change>1.5或<0.67) RASEs分析(FDR 5%) 关键基因(CCNB1、CCND1、TPM1)的RIP-qPCR验证

摘要

YBX1是一种DNA/RNA结合蛋白,与多种疾病有关,但其在内膜增生(IH)中的作用仍不清楚。本研究通过敲低实验研究YBX1在大鼠主动脉平滑肌细胞(RASMCs)中的功能。结果表明,YBX1敲低可减少细胞增殖和迁移,同时诱导凋亡。ELISA和western blot分析显示,抗炎因子IL10以及表型转化标志物Calponin和Myocardin的水平升高。转录组测序鉴定出1598个差异表达基因(DEGs),其中347个上调,1251个下调。上调的DEGs与ECM-受体相互作用和Wnt信号等通路相关,而下调的基因涉及细胞周期和p53信号。此外,还注意到629个显著的可变剪接事件,主要影响与细胞分裂和迁移相关的通路。对YBX1结合RNA和RNA-seq数据的综合分析突出了关键DEGs,如CCNB1和TPM1,它们对血管细胞行为至关重要。本研究强调了YBX1在RASMCs中的重要作用,并为IH治疗提供了潜在的治疗靶点。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
YBX1在内膜增生中通过何种机制调控大鼠主动脉平滑肌细胞的功能?
核心机制
YBX1通过结合靶基因RNA,调控细胞周期相关基因的表达和可变剪接,从而影响RASMCs的增殖、迁移和凋亡,参与内膜增生的发展。
主要证据
在RASMCs中敲低YBX1后,检测到细胞增殖和迁移下降、凋亡增加,IL10、Calponin和Myocardin表达上调;RNA-seq显示大量DEGs和RASEs,且YBX1结合基因与DEGs/RASGs有显著重叠,RIP-qPCR验证了YBX1与CCNB1、TPM1等转录本的结合。
研究意义
本研究揭示了YBX1在内膜增生中的重要作用,并确定了YBX1的潜在下游靶点,可作为未来IH及其他心血管疾病的候选治疗靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

YBX1敲低细胞模型建立

验证shRNA介导的YBX1敲低效率

使用靶向Ybx1的shRNA慢病毒感染RASMCs,通过嘌呤霉素筛选稳定细胞系,并通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。

2

细胞表型功能检测

评估YBX1敲低对细胞增殖、凋亡、迁移及表型转化的影响

通过CCK-8检测细胞活力,Annexin V/PI流式凋亡检测,transwell迁移实验,ELISA检测IL10,Western blot检测Calponin和Myocardin。

3

转录组测序及差异表达分析

鉴定YBX1调控的差异表达基因及其富集通路

提取RNA进行链特异性RNA-seq,比对到mRatBN7.2基因组,使用DESeq2筛选DEGs,并进行KEGG和GO富集分析。

4

可变剪接分析

鉴定YBX1调控的可变剪接事件及其功能

使用ABLas流程鉴定ASEs和RASEs,对RASGs进行GO富集分析,并通过RT-qPCR验证Rhoc的A5SS事件。

5

RIP-seq数据分析及整合

鉴定YBX1结合的RNA靶点,并整合DEGs和RASGs分析其调控机制

下载GSE159153 RIP-seq数据,重新分析峰,与RNA-seq的DEGs和RASGs取交集,并通过RIP-qPCR验证关键靶点(CCNB1、CCND1、TPM1)的结合。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DMEM培养基ProcellCM-R076
胎牛血清Gibco10091148
青霉素-链霉素HycloneSV30010
嘌呤霉素----
逆转录试剂盒VazymeR323-01
热循环仪Bio-RadT100
实时荧光定量PCR仪Applied BiosystemsQuantStudio 5
RIPA裂解液ProteintechPR20001
蛋白酶抑制剂混合物Sigma4693116001
蛋白上样缓冲液SolarbioP1040
PVDF膜MilliporeISEQ00010
YBX1抗体Abcamab239875
GAPDH抗体Proteintech60004-1-lg
二抗(抗兔)ProteintechSA00001-2
二抗(抗小鼠)ABclonalAS003
增强化学发光试剂BeyotimeP0018FM
CCK-8试剂盒MCEHY-K0301
酶标仪BioTekELX800
Annexin V-Alexa Fluor647/PI细胞凋亡检测试剂盒YEASEN40304ES60
流式细胞仪BDFACSCanto
Transwell小室Corning3422
结晶紫BeyotimeC0121
倒置显微镜MshotMF52-N
RQ1 DNasePromegaM6101
VAHTS通用V8 RNA-seq文库制备试剂盒VazymeNR605
VAHTS mRNA捕获磁珠VazymeN401
VAHTS RNA多重寡核苷酸Set 1VazymeN323
Illumina NovaSeq 6000测序仪Illumina--
RNA酶抑制剂Takara2313A
蛋白酶抑制剂混合物BimakeB14001
YBX1抗体SigmaY0396-200UL
对照IgG抗体ABclonalAC005
蛋白A/G磁珠Thermo Scientific26162
蛋白酶KSangon BiotechB600169-0002

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
YBX1敲低
shRNA序列、MOI、嘌呤霉素筛选浓度和时间
阅读提示:Materials and Methods 2.1, 2.2
细胞功能检测
CCK-8细胞接种密度、检测时间;凋亡检测试剂盒用量;transwell迁移时间、细胞数、FBS浓度
阅读提示:Materials and Methods 2.5, 2.6, 2.7
分子检测
抗体稀释比例、孵育时间;ELISA试剂盒来源
阅读提示:Materials and Methods 2.4, 2.8
转录组分析
DEGs阈值、RASEs统计方法、数据库版本
阅读提示:Materials and Methods 2.11, 2.12
RIP实验
抗体、磁珠用量、洗涤条件、RNA提取方法
阅读提示:Materials and Methods 2.14