建立CS暴露哮喘小鼠模型
模拟CS暴露加重哮喘的病理过程
C57BL/6J小鼠分为对照组、CS组、HDM组和HDM/CS组，HDM致敏和挑战结合CS暴露，评估AHR、肺部病理、炎性细胞浸润。
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白细胞介素-35通过gp130/STAT3/铁死亡轴抑制中性粒细胞胞外诱捕网以改善香烟烟雾暴露哮喘加重期间的Th17/Treg免疫失衡
Interleukin-35 inhibits NETs to ameliorate Th17/Treg immune imbalance during the exacerbation of cigarette smoke exposed-asthma via gp130/STAT3/ferroptosis axis.
实验完整度
高包含体外试验、体内动物模型、临床样本及多组学分析，验证了IL-35通过gp130/STAT3/铁死亡轴抑制NET形成并恢复免疫平衡。
主要模型
HDM/CS诱导的CS暴露哮喘小鼠模型（C57BL/6J雌性小鼠） dHL-60细胞（人早幼粒白血病细胞系分化） 人外周血中性粒细胞（PBNs） 人外周血单个核细胞（PBMCs）来源的DC和naïve CD4+ T细胞
重点核对
C57BL/6J雌性小鼠，6-8周龄，HDM致敏（20 μg i.p.）和挑战（10 μg i.n.），CS暴露（10支香烟，30分钟，每日两次，每周5天） DNase I处理剂量：10 mg/kg i.p. IL-35处理剂量：400 ng/只 i.p. SC144剂量：10 mg/kg i.p. Colivelin TFA剂量：1 mg/kg i.p.
摘要
香烟烟雾（CS）暴露会加剧中性粒细胞的积聚。IL-35是一种具有抗炎特性的新型细胞因子，参与对哮喘的保护作用。然而，中性粒细胞的生物学作用以及IL-35在CS暴露哮喘中的精确分子机制仍不清楚。我们发现，CS暴露哮喘的加重导致中性粒细胞计数显著增加以及DC-Th17/Treg免疫应答失衡。RNA测序显示，NETs作为中性粒细胞的关键生物学过程的一部分，在CS暴露哮喘加重的背景下显著上调，而IL-35治疗下调了NET相关基因的表达。靶向降解NETs，而非清除中性粒细胞，减轻了CS暴露哮喘。机制上，STAT3磷酸化促进铁死亡，加剧NET释放，进而增强树突状细胞（DC）抗原呈递，激活T细胞，并特异性促进Th17细胞分化，同时抑制Treg细胞。IL-35作用于gp130受体，减轻了STAT3介导的铁死亡相关的NET形成。总之，我们的研究揭示了IL-35抑制NET形成的新机制，从而减轻中性粒细胞性炎症并恢复CS暴露哮喘中的DC-Th17/Treg失衡，凸显了IL-35作为靶向治疗策略的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CS暴露如何加重哮喘，以及IL-35是否通过调控NETs改善免疫失衡及其分子机制。
- 核心机制
- IL-35作用于中性粒细胞gp130受体，通过抑制STAT3磷酸化，减少铁死亡相关的NET形成，从而减轻NET驱动的DC活化和Th17/Treg失衡。
- 主要证据
- 体内实验显示IL-35处理降低NET形成（Cit-H3/MPO）并改善炎症；体外实验显示IL-35抑制HDM/CSE诱导的NET形成，且STAT3过表达或gp130敲低可阻断其效应。
- 研究意义
- IL-35通过gp130/STAT3/铁死亡轴抑制NET形成，为CS暴露哮喘加重提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估中性粒细胞清除的效果
确定整体清除中性粒细胞对CS暴露哮喘的影响
使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞，对比同型对照，观察炎症参数、DC成熟和Th17/Treg比例。
检测NET形成
验证CS暴露哮喘中NETs是否增加
通过Western blot、免疫荧光、PI染色检测小鼠肺组织和体外刺激的中性粒细胞中NETs。
NETs降解治疗
验证清除NETs是否能缓解CS暴露哮喘
给予DNase I处理，评估AHR、肺部病理、DC成熟和Th17/Treg比例。
体外验证NETs对DC和T细胞的影响
探究NETs是否作为连接天然免疫和适应性免疫的桥梁
用HDM/CSE诱导的NETs处理DCs，与naïve CD4+ T细胞共培养，检测DC成熟和Th17/Treg分化。
IL-35对CS暴露哮喘小鼠的治疗作用
评估IL-35治疗对疾病表型和NET形成的影响
给予重组IL-35，检测AHR、病理、中性粒细胞浸润、DC成熟、Th17/Treg比例和NET形成。
体外机制研究：IL-35抑制NET形成
验证IL-35对NET形成的直接抑制作用及其分子机制
体外用IL-35预处理中性粒细胞和dHL-60细胞，检测NET形成、ROS、铁死亡标志物，并使用STAT3过表达或gp130 siRNA干预。
体内验证gp130/STAT3轴
验证gp130/STAT3轴在IL-35保护作用中的必要性
使用SC144（gp130抑制剂）或Colivelin TFA（STAT3激活剂）联合IL-35处理，评估AHR、病理、免疫细胞和NET形成。
临床样本相关性分析
分析NET相关标志物和IL-35与肺功能的相关性
检测哮喘患者（吸烟与非吸烟）血清中MPO-DNA、NE、HMGB-1、IL-17A和IL-35水平，并与肺功能指标进行相关分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 屋尘螨 | Greer Laboratories | XPB82D3A2.5 |
| 铝佐剂 | ThermoFisher Scientific | 77161 | |
| 药物干预 | 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | DN25 |
| 白细胞介素-35 | PeproTech | 200-37 | |
| SC144 | MCE | HY-15614 | |
| Colivelin TFA | Macklin | C912884 | |
| 中性粒细胞清除 | 抗Ly6G抗体 | Bio X Cell | BE0075 |
| 大鼠IgG2a同型对照抗体 | BioXCell | BE0089 | |
| 细胞培养 | HL-60专用培养基 | Pricella | CM-0110 |
| 细胞分化 | 二甲基亚砜 | MP | 0219605580 |
| 流式分析 | 抗CD11b抗体 | BioLegend | 301305 |
| 药物处理 | 重组人IL-35 | AdipoGen | CHI-HF-21035 |
| Cl-amidine | MCE | HY-100574A | |
| Fer-1 | APExBIO | A4371 | |
| 细胞刺激 | 屋尘螨主要变应原Der p1 | Greer Laboratories | XPB91D3A25 |
| 基因转染 | gp130 siRNA | TranSheep Bio | -- |
| 乱序对照 | TranSheep Bio | -- | |
| pCDH-MSCV-STAT3载体 | TranSheep Bio | -- | |
| 脂质体3000 | Vazyme | TL301-01 | |
| ELISA | IL-35 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-1683H1 |
| IL-17A ELISA试剂盒 | Meimian | MM-2117H1 | |
| MPO-DNA ELISA试剂盒 | Meimian | MM-2467H1 | |
| HMGB-1 ELISA试剂盒 | Meimian | MM-1623H1 | |
| NE ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1946 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解缓冲液 | HUAYUN | HB504A |
| 蛋白酶抑制剂 | HUAYUN | HYY187 | |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Epizyme | PG212 |
| PVDF膜 | Merck Millipore | ISEQ00010 | |
| 脱脂牛奶 | BD | 232100 | |
| 牛血清白蛋白 | MP | 180728 | |
| 抗STAT3抗体 | CST | 8204S | |
| 抗p-STAT3抗体 | CST | 8204S | |
| 抗gp130抗体 | CST | 3732S | |
| 抗瓜氨酸化组蛋白H3抗体 | Abcam | ab5103 | |
| 抗GPX4抗体 | Abmart | T56959 | |
| 抗转铁蛋白受体1抗体 | Abmart | T56618 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | HUABIO | R1102-1 | |
| 抗GAPDH抗体 | HUABIO | ET1601-4 | |
| 铁死亡检测 | MDA检测试剂盒 | HUAYUN | HYZ410 |
| 4-HNE ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0128c | |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 | Hitachi | SU8100 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CS暴露哮喘小鼠模型 | 小鼠品系、性别、年龄、HDM致敏和挑战方案、CS暴露频率和时间、各组别样本量。 阅读提示：Methods 2.1节 |
| 药物干预 | DNase I、IL-35、SC144、Colivelin TFA的剂量、给药方式、给药频率和时间点。 阅读提示：Methods 2.2节 |
| 中性粒细胞清除 | 抗Ly6G抗体剂量、给药频率和时间。 阅读提示：Methods 2.3节 |
| 体外细胞模型 | HL-60细胞分化条件（DMSO浓度、时间）、刺激物浓度（HDM和CSE）、IL-35和抑制剂浓度。 阅读提示：Methods 2.4节 |
| 基因操作 | siRNA序列、转染试剂、转染时间。 阅读提示：Methods 2.5节 |
| NETs检测 | 抗体（anti-Cit-H3、anti-MPO）、染色方法、定量方法。 阅读提示：Results 3.3节及图4图注 |
| 铁死亡检测 | MDA、GSH/GSSG、4-HNE检测试剂盒和操作步骤。 阅读提示：Methods 2.8节 |
| 统计分析 | 统计方法（t检验或ANOVA），多重比较校正方法，显著性水平。 阅读提示：Methods 2.10节 |